Najbardziej dopasowane pod względem HLA limfocyty T cytotoksyczne (CTL) swoiste dla wirusa allogenicznego (CHALLAH)

Pacjenci mogą być poddani badaniu przesiewowemu pod kątem włączenia do badania, jeśli choroba utrzymuje się pomimo standardowej terapii, jak określono w kryteriach włączenia. Na tym etapie zostanie przeprowadzone wyszukiwanie dostępnych linii. Linie zostały wygenerowane od dawców HSCT, którzy zgodzili się na użycie CTL niepotrzebnych dla ich biorcy do badań lub od zwykłych dawców. Wszyscy dawcy zostali poddani badaniu przesiewowemu i uznani za kwalifikujących się jako dawcy przeszczepów. Wyprodukujemy również dodatkowe linie w celu pokrycia typowych typów HLA i skonsultujemy się z NMDP w celu ustalenia, jakie typy HLA byłyby pożądane. Dodatkowi dawcy zostaną zbadani przez lekarza centrum dawców przeszczepów i muszą zostać uznani za kwalifikujących się przed wyprodukowaniem linii.

Linie CTL: Użyjemy linii CTL specyficznych dla triwirusów, wygenerowanych zgodnie z wcześniejszym opisem. Generowanie linii CTL specyficznych dla triwirusów wymaga wygenerowania kilku różnych komponentów z PBMC. Linia CTL będzie pochodzić z limfocytów T krwi obwodowej dawcy, przez wielokrotną stymulację komórkami prezentującymi antygen (APC) prezentującymi antygeny CMV, EBV i adenowirusa oraz namnażanie interleukiną-2 (IL-2). Komórki APC stosowane do stymulacji i namnażania limfocytów T swoistych dla CMV będą pochodzić z komórek jednojądrzastych pacjenta i limfocytów B.

Aby zainicjować linię CTL specyficzną dla triwirusa, PBMC transdukuje się wektorem adenowirusowym (Ad5f35-pp65) wykazującym ekspresję immunodominującego antygenu CMV, pp65. Frakcja monocytów PBMC eksprymowała i prezentowała epitopy peptydowe CMV-pp65 specyficznej dla CMV frakcji komórek T PBMC, podczas gdy białka wirionu z wektora adenowirusowego przetwarzano i prezentowano frakcji komórek T specyficznej dla adenowirusa.

Aby namnażać limfocyty T specyficzne dla triwirusa, użyliśmy linii komórek limfoblastoidalnych B transformowanych EBV (EBV-LCL) transdukowanych Ad5f35-pp65. Ta transdukcja umożliwia komórkom T EBV-LCL prezentację peptydów wirionu CMV-pp65 i adenowirusa, jak również endogennie eksprymowanych antygenów EBV.

EBV-LCL są uzyskiwane z limfocytów PBMC-B przez zakażenie szczepem laboratoryjnym wirusa Epsteina-Barra (EBV) o stopniu czystości klinicznej. Do wygenerowania EBV-LCL potrzeba około 5 x 10^6 PBMC lub 5 do 10 ml krwi

Pod koniec okresu hodowli CTL określono częstość występowania limfocytów T specyficznych dla każdego wirusa, stosując odczynniki tetramerowe, jeśli były dostępne. Aby przetestować funkcjonalną specyficzność antygenową CTL, użyjemy nakładających się bibliotek peptydów dla pp65 i heksonu adenowirusa oraz autologicznych i allogenicznych LCL w testach Elispot i przeprowadzimy testy cytotoksyczności przy użyciu niezmodyfikowanych blastów PHA i LCL nietransdukowanych lub transdukowanych Adhexonem i CMVpp65 pepmix LUB LCL transdukowane Ad5f35-null i Ad5f35-pp65. Niektóre linie zostaną wysłane w celu dalszej charakterystyki do NIH, gdzie dr Melenhorst i Barrett opracowują testy do przewidywania alloreaktywności, w których badają limfocyty T specyficzne dla antygenu wirusa przy użyciu obszernego panelu aktywowanych limfocytów T jako komórek prezentujących antygen (T-APC). Wiersze te będą oznaczone wyłącznie numerem komponentu i nie będą miały identyfikatorów podmiotu.

Linie CTL zostaną również sprawdzone pod kątem tożsamości, fenotypu i sterylności oraz poddane kriokonserwacji przed podaniem zgodnie z SOP. Kryteria dopuszczenia do podania CTL pacjentom obejmują żywotność >70%, ujemną hodowlę w kierunku bakterii i grzybów przez co najmniej 7 dni, badanie endotoksyn mniejsze lub równe 5EU/ml, ujemny wynik w kierunku mykoplazmy, <2% limfocytów B CD19 dodatnich, <2% monocytów CD14-dodatnich (lub <2% komórek CD83-dodatnich, jeśli jako stymulatory zastosowano komórki dendrytyczne) i tożsamość HLA.

Brak dopasowanej linii CTL: Jeśli nie jest dostępna dopasowana linia, pacjent zostanie zarejestrowany, aby można było ocenić wykonalność podejścia i zebrać również ostateczny wynik.

Dostępna linia CTL, ale status pacjenta się zmienia: przebieg kliniczny pacjenta, który zmienia się między badaniem przesiewowym a infuzją, nie otrzyma CTL i będzie obserwowany pod kątem ostatecznego wyniku.

Dane dotyczące przeżycia zostaną zebrane poprzez zwrócenie się do ośrodka transplantacyjnego o przesłanie rutynowego formularza niezbędnych danych do przeszczepu, który jest wysyłany do bazy danych wyników przeszczepu komórek macierzystych po 100 dniach i 1 roku i zawiera dane dotyczące statusu przeżycia i innych wskaźników wyniku.

Kryteria wyboru linii CTL: Ogólnie wybrana zostanie linia pasująca do największej liczby loci HLA. Preferowane będzie dopasowanie na poziomie alleli, ale akceptowany będzie poziom antygenu lub HLA-A i HLA-B. Jednak zostanie również zwrócona uwaga na rodzaj infekcji i aktywność linii przeciwko temu wirusowi. Na przykład dla pacjenta z zakażeniem adenowirusem linia, która pasuje w 2 loci, ale rozpoznaje adenowirus za pośrednictwem tych antygenów, byłaby korzystniejsza niż linia dopasowana w 3 loci, ale bez wykazanej aktywności przeciwko adenowirusowi. Przewodniczący protokołu omówi każdy przypadek z głównymi badaczami w każdym ośrodku, aby określić optymalną linię CTL dla każdego pacjenta. Jeśli więcej niż jedna linia pasuje i nie ma wystarczającej liczby komórek do pokrycia dodatkowych infuzji, zarezerwowana zostanie druga linia CTL na wypadek, gdyby dodatkowe infuzje były uzasadnione. Pacjenci z częściową odpowiedzią kwalifikują się do otrzymania dodatkowej dawki.

Premedykacja: Pacjenci będą premedykowani Benadrylem 1 mg/kg (maks. 50 mg) IV i Tylenolem 10 mg/kg (maks. 650 mg) PO.

Pacjenci będą monitorowani zgodnie ze standardami instytucjonalnymi dotyczącymi podawania produktów krwiopochodnych i co najmniej będą monitorowani zgodnie z poniższymi: • Pacjenci powinni pozostać w klinice przez co najmniej jedną godzinę • Pacjenci powinni pozostawać pod ciągłym pulsoksymetrem przez co najmniej 30 minut • Funkcje życiowe należy monitorować pod koniec infuzji, a następnie po 30 i 60 minutach

Opieka wspomagająca: Pacjenci otrzymają opiekę wspomagającą w przypadku ostrej lub przewlekłej toksyczności, w tym składniki krwi lub antybiotyki, a także inne odpowiednie interwencje.

Jeśli pacjent ma częściową odpowiedź, kwalifikuje się do otrzymania do 4 dodatkowych dawek w odstępach co najmniej 2 tygodni i jeśli spełnia kryteria kwalifikacji do kolejnych linii. Dawki te pochodziłyby z oryginalnej linii infuzyjnej, gdyby dostępna była wystarczająca ilość fiolek, ale mogą pochodzić z innej linii, jeśli w oryginalnej linii jest niewystarczająca liczba komórek.

Oceny kontrolne: Termin wizyt kontrolnych zależy od daty wlewu CTL. Jeśli pacjent otrzymał wiele dawek CTL, harmonogram resetuje się ponownie na początku, więc obserwacja dotyczy ostatniej dawki CTL.

Kontrola będzie miała miejsce po 7 dniach, 14 dniach, 21 dniach, 28 dniach, 42 dniach, 90 dniach, 180 dniach i 365 dniach (+/- 2 dni do 8. tygodnia i +/- 14 dni do 90. dnia, 120 i +/- 28 dni przez 6 i 12 miesięcy, po rejestracji..)

Następujące oceny są uważane za standardowe, o ile nie zostały oznaczone poniżej przez „*”:

Wstępna infuzja: 1. Wywiad i badanie fizykalne, w tym wzrost i waga 2. Miano wirusa EBV, adenowirusa, CMV 3. Biopsja miejsca zmiany chorobowej, jeśli to właściwe 4. Badania obrazowe, jeśli to właściwe 5. Kompletne informacje na temat stopnia zaawansowania i klasyfikacji ostrej GVHD, w tym oceny wysypki, biegunki, nudności/wymiotów, masy ciała i badań czynnościowych wątroby 6. CBC z rozmazem, liczba płytek krwi 7. Próby czynnościowe wątroby (bilirubina, fosfataza zasadowa, AST, ALT) plus kreatynina 8. Poziom takrolimusu/cyklosporyny 9. * Próbki do badania laboratoryjne

Po infuzji: 1. Miana wirusa CMV, EBV, adenowirusa co tydzień w 1, 2, 3, 4 i 6 tygodniu oraz w 3, 6 i 12 miesiącu. 2. Pełne informacje na temat stopnia zaawansowania i stopniowania ostrej GVHD, w tym oceny wysypki, biegunki, nudności/wymiotów, masy ciała i testów czynności wątroby co tydzień do 45. dnia 3. Ocena przewlekłej GVHD (jeśli występuje) 3, 6, 9 i 12 miesięcy 4. CBC z różnicowaniem i liczbą płytek krwi w 1, 2, 3, 4 i 6 tygodniu. 5. Toksyczność związana z infuzją w ciągu 24 godzin i ocena toksyczności co tydzień do dnia 30 i ostra GVHD do dnia 45 6. Dawka steroidu co tydzień do dnia 42 oraz 3, 6 i 9 miesięcy 7. * Próbki do badań laboratoryjnych w dniach 0, 14, 28 i 90 8. Infekcje do dnia 42 oraz w 3, 6 i 12 miesiącu

Pomocnicze badania laboratoryjne będą obejmować: 1) Ocena odporności specyficznej dla wirusa w oparciu o poziomy CTL mierzone testami ELISPOT lub testami tetramerowymi. 2) Trwałość komórek T poddanych infuzji w oparciu o PCR dla antygenu niewspólnego

Zgłaszanie zgonów pacjentów: Informacje o śmierci odbiorcy należy wprowadzić do internetowego systemu wprowadzania danych w ciągu 24 godzin od uzyskania informacji o śmierci pacjenta. Jeżeli przyczyna zgonu nie jest w tym czasie znana, nie trzeba jej odnotowywać w tym czasie. Jednak po ustaleniu przyczyny śmierci formularz musi zostać zaktualizowany.

Ocena dawcy: - Pełny wywiad i badanie przedmiotowe - CBC, płytki krwi, rozmaz - Białko całkowite, albumina, bilirubina całkowita, fosfataza alkaliczna, ALT, AST - Przeciwciała HIV-1, przeciwciała HIV-2, HIV NAT, HTLV-1/2 przeciwciała, HBsantigen, przeciwciała HBc, HCV NAT, przeciwciała CMV, RPR, NAT wirusa Zachodniego Nilu i testy Chagasa - typowanie ABO i Rh - Po zakończeniu oceny lekarz transplantacyjny odnotuje w dokumentacji medycznej biorcy i dawcy, że testy zostały ocenione, a dawca jest akceptowalny.