Am ehesten HLA-übereinstimmende allogene virusspezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) (CHALLAH)

Patienten können für den Studieneintritt gescreent werden, wenn sie trotz Standardtherapie, wie in den Einschlusskriterien definiert, eine persistierende Erkrankung haben. In diesem Stadium wird eine Suche nach den verfügbaren Leitungen durchgeführt. Linien wurden von HSCT-Spendern generiert, die der Verwendung von CTLs zugestimmt haben, die für ihren Empfänger nicht für Forschungszwecke benötigt werden, oder von normalen Spendern. Alle Spender wurden überprüft und als Transplantationsspender in Betracht gezogen. Wir werden auch zusätzliche Linien mit dem Ziel herstellen, gängige HLA-Typen abzudecken, und uns mit dem NMDP beraten, um zu bestimmen, welche HLA-Typen wünschenswert wären. Zusätzliche Spender werden von einem Arzt des Transplantationsspendezentrums untersucht und müssen als geeignet erachtet werden, bevor eine Linie hergestellt werden kann.

CTL-Linien: Wir verwenden Trivirus-spezifische CTL-Linien, die wie zuvor beschrieben generiert wurden. Die Erzeugung trivirusspezifischer CTL-Linien erfordert die Erzeugung mehrerer unterschiedlicher Komponenten aus PBMC. Die CTL-Linie wird aus Spender-T-Zellen aus peripherem Blut durch mehrfache Stimulation mit Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), die CMV-, EBV- und Adenovirus-Antigene präsentieren, und Expansion mit Interleukin-2 (IL-2) gewonnen. Die zur Stimulierung und Expansion der CMV-spezifischen T-Zellen verwendeten APCs werden aus mononukleären Zellen und B-Lymphozyten des Patienten gewonnen.

Um die Trivirus-spezifische CTL-Linie zu initiieren, werden PBMC mit einem Adenovirus-Vektor (Ad5f35-pp65) transduziert, der das immundominante Antigen von CMV, pp65, exprimiert. Die Monozytenfraktion von PBMC exprimierte CMV-pp65-Peptidepitope und präsentierte sie der CMV-spezifischen T-Zellfraktion der PBMC, während die Virionproteine ​​aus dem Adenovirusvektor prozessiert und der Adenovirus-spezifischen T-Zellfraktion präsentiert wurden.

Um Trivirus-spezifische T-Zellen zu expandieren, verwendeten wir EBV-transformierte B-Lymphoblastoid-Zelllinien (EBV-LCLs), die mit Ad5f35-pp65 transduziert wurden. Diese Transduktion ermöglicht es den EBV-LCLs, den T-Zellen CMV-pp65 und Adenovirus-Virion-Peptide sowie endogen exprimierte EBV-Antigene zu präsentieren.

EBV-LCLs werden von PBMC-B-Lymphozyten durch Infektion mit einem klinisch reinen Laborstamm des Epstein-Barr-Virus (EBV) gewonnen. Etwa 5 x 10 ^ 6 PBMC oder 5 bis 10 ml Blut sind erforderlich, um das EBV-LCL zu erzeugen

Am Ende der CTL-Kultivierungsperiode wurde die Häufigkeit von T-Zellen, die für jedes Virus spezifisch sind, unter Verwendung von Tetramer-Reagenzien, sofern verfügbar, bestimmt. Um die funktionelle Antigenspezifität der CTL zu testen, werden wir überlappende Peptidbibliotheken für pp65 und Adenovirus-Hexon sowie autologe und allogene LCLs in Elispot-Assays verwenden und Zytotoxizitätsassays mit unmodifizierten PHA-Blasten und LCLs durchführen, die nicht transduziert oder mit Adhexon und CMVpp65 pepmix ODER LCL transduziert wurden transduziert mit Ad5f35-null und Ad5f35-pp65. Von einigen Linien werden Aliquots zur weiteren Charakterisierung an das NIH geschickt, wo Dr. Melenhorst und Barrett Assays zur Vorhersage der Alloreaktivität entwickeln, bei denen sie virusantigenspezifische T-Zellen unter Verwendung eines umfangreichen Panels aktivierter T-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen (T-APC) untersuchen. Diese Zeilen werden nur mit der Komponentennummer beschriftet und haben keine Betreff-IDs.

Die CTL-Linien werden außerdem auf Identität, Phänotyp und Sterilität überprüft und vor der Verabreichung gemäß SOP kryokonserviert. Zu den Freigabekriterien für die Verabreichung der CTL an Patienten gehören Lebensfähigkeit >70 %, negative Kultur für Bakterien und Pilze für mindestens 7 Tage, Endotoxintest kleiner oder gleich 5 EU/ml, negatives Ergebnis für Mycoplasma, <2 % CD19-positive B-Zellen, < 2 % CD14-positive Monozyten (oder < 2 % CD83-positive Zellen, wenn dendritische Zellen als Stimulatoren verwendet wurden) und HLA-Identität.

Keine übereinstimmende CTL-Linie verfügbar: Wenn keine übereinstimmende Linie verfügbar ist, wird der Patient registriert, damit die Durchführbarkeit des Ansatzes beurteilt werden kann, und das eventuelle Ergebnis wird ebenfalls erfasst.

CTL-Linie verfügbar, aber Patientenstatus ändert sich: Patienten, die sich zwischen dem Screening und der Infusion im klinischen Verlauf ändern, wird kein CTL gegeben und sie werden hinsichtlich des eventuellen Ergebnisses verfolgt.

Überlebensdaten werden gesammelt, indem das Transplantationszentrum gebeten wird, das routinemäßige Formular „Transplant Essential Data“ einzureichen, das nach 100 Tagen und 1 Jahr an die Stammzelltransplantationsergebnis-Datenbank gesendet wird und Daten zum Überlebensstatus und andere Ergebnismessungen enthält.

Kriterien für die Auswahl der CTL-Linie: Im Allgemeinen wird die Linie ausgewählt, die mit der höchsten Anzahl von HLA-Loci übereinstimmt. Der Abgleich auf Allelebene wird bevorzugt, aber die Antigenebene wird akzeptiert oder HLA-A und HLA-B. Es werden jedoch auch die Art der Infektion und die Aktivität der Linie gegen dieses Virus berücksichtigt. Zum Beispiel wäre für einen Patienten mit einer Adenovirusinfektion eine Linie, die an 2 Loci passt, aber eine Erkennung von Adenovirus aufweist, die durch diese Antigene vermittelt wird, einer Linie vorzuziehen, die an 3 Loci passt, aber ohne nachgewiesene Aktivität gegen Adenovirus. Der Protokollvorsitzende bespricht jeden Fall mit den Hauptforschern in jedem Zentrum, um die optimale CTL-Linie für jeden Patienten zu bestimmen. Wenn mehr als eine Linie übereinstimmt und nicht genügend Zellen vorhanden sind, um zusätzliche Infusionen abzudecken, wird eine zweite CTL-Linie reserviert, falls zusätzliche Infusionen gerechtfertigt sind. Patienten mit teilweisem Ansprechen können eine zusätzliche Dosis erhalten.

Prämedikation: Die Patienten werden mit Benadryl 1 mg/kg (max. 50 mg) IV und Tylenol 10 mg/kg (max. 650 mg) PO prämediziert.

Die Patienten werden gemäß den institutionellen Standards für die Verabreichung von Blutprodukten und mindestens wie folgt überwacht: • Patienten sollten mindestens eine Stunde in der Klinik bleiben • Patienten sollten mindestens 30 Minuten lang kontinuierlich pulsoximetrisch behandelt werden • Die Vitalfunktionen sollten am Ende der Infusion und dann nach 30 und 60 Minuten überwacht werden

Unterstützende Behandlung: Die Patienten erhalten eine unterstützende Behandlung bei akuter oder chronischer Toxizität, einschließlich Blutkomponenten oder Antibiotika, und gegebenenfalls andere Interventionen.

Wenn ein Patient teilweise anspricht, kann er bis zu 4 zusätzliche Dosen in Abständen von mindestens 2 Wochen erhalten und wenn er die Eignungskriterien für nachfolgende Linien erfüllt. Diese Dosen würden von der ursprünglich infundierten Linie stammen, wenn genügend Fläschchen verfügbar wären, können aber von einer anderen Linie stammen, wenn die ursprüngliche Linie nicht genügend Zellen enthält.

Nachuntersuchungen: Der Zeitpunkt der Nachuntersuchungen basiert auf dem Datum der CTL-Infusion. Wenn ein Patient mehrere CTL-Dosen erhält, wird der Plan wieder am Anfang zurückgesetzt, sodass sich die Nachsorge auf die letzte CTL-Dosis bezieht.

Nachuntersuchungen erfolgen nach 7 Tagen, 14 Tagen, 21 Tagen, 28 Tagen, 42 Tagen, 90 Tagen, 180 Tagen und 365 Tagen (+/- 2 Tage bis Woche 8 und +/- 14 Tage für Tage 90, 120, und +/- 28 Tage für 6 und 12 Monate, nach Immatrikulation..)

Die folgenden Beurteilungen gelten als Behandlungsstandard, sofern sie nicht unten durch „*“ gekennzeichnet sind:

Vor der Infusion: 1. Anamnese und körperliche Untersuchung einschließlich Größe und Gewicht 2. Viruslasten für EBV, Adenovirus, CMV 3. Stelle der Biopsieerkrankung, falls zutreffend 4. Bildgebungsstudien, falls zutreffend 5. Vollständige Stadieneinteilung und Einstufung der akuten GVHD, einschließlich Bewertungen Hautausschlag, Durchfall, Übelkeit/Erbrechen, Gewichts- und Leberfunktionstests 6. CBC mit Differential, Thrombozytenzahl 7. Leberfunktionstests (Bilirubin, alkalische Phosphatase, AST, ALT) plus Kreatinin 8. Tacrolimus/Cyclosporin-Spiegel 9. * Proben für Labor studien

Post-Infusion: 1. Viruslasten für CMV, EBV, Adenovirus wöchentlich nach 1, 2, 3, 4 und 6 Wochen und 3, 6 und 12 Monaten. 2. Vollständige Einstufungs- und Einstufungsinformationen der akuten GVHD, einschließlich Beurteilungen von Hautausschlag, Durchfall, Übelkeit/Erbrechen, Gewicht und Leberfunktionstests wöchentlich bis Tag 45 3. Beurteilung der chronischen GVHD (falls vorhanden) 3, 6, 9 und 12 Monate 4. CBC mit Differential- und Thrombozytenzahl nach 1, 2, 3, 4 und 6 Wochen. 5. Infusionsbedingte Toxizitäten innerhalb von 24 Stunden und Toxizitätsbewertung wöchentlich bis Tag 30 und akute GVHD bis Tag 45 6. Steroiddosis wöchentlich bis Tag 42 sowie 3, 6 und 9 Monate 7. * Proben für Laborstudien an den Tagen 0, 14, 28 und 90 8. Infektionen bis Tag 42 und nach 3, 6 und 12 Monaten

Ergänzende Laborstudien umfassen: 1) Bewertung der virusspezifischen Immunität basierend auf CTL-Spiegeln, gemessen mit ELISPOT-Assays oder Tetramer-Assays. 2) Persistenz von infundierten T-Zellen basierend auf PCR für nicht geteiltes Antigen

Melden von Todesfällen von Patienten: Die Todesinformationen des Empfängers müssen innerhalb von 24 Stunden nach Bekanntwerden des Todes eines Patienten in das webbasierte Dateneingabesystem eingegeben werden. Wenn die Todesursache zu diesem Zeitpunkt unbekannt ist, muss sie zu diesem Zeitpunkt nicht erfasst werden. Sobald jedoch die Todesursache feststeht, muss das Formular aktualisiert werden.

Spenderbewertung: - Vollständige Anamnese und körperliche Untersuchung - CBC, Blutplättchen, Differential - Gesamtprotein, Albumin, Gesamtbilirubin, alkalische Phosphatase, ALT, AST, - HIV-1-Antikörper, HIV-2-Antikörper, HIV-NAT, HTLV-1/2 Antikörper, HBsantigen, HBc-Antikörper, HCV-NAT, CMV-Antikörper, RPR, West-Nil-Virus-NAT und Chagas-Test – ABO- und Rh-Typisierung – Wenn die Bewertung abgeschlossen ist, vermerkt der Transplantationsarzt in den Krankenakten des Empfängers und des Spenders, dass die Tests durchgeführt wurden ausgewertet wurden und der Spender akzeptabel ist.