Аллогенные вирусспецифические цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), наиболее точно соответствующие HLA (CHALLAH)

Пациенты могут быть подвергнуты скринингу для включения в исследование, если у них сохраняется персистирующее заболевание, несмотря на стандартную терапию, как определено в критериях включения. На этом этапе будет произведен поиск доступных строк. Линии были получены от доноров ТГСК, давших согласие на использование ЦТЛ, не требуемых их реципиенту для исследований, или от нормальных доноров. Все доноры прошли скрининг и признаны подходящими донорами для трансплантации. Мы также будем производить дополнительные линии с целью охвата распространенных типов HLA и проконсультируемся с NMDP, чтобы определить, какие типы HLA желательны. Дополнительные доноры будут проверены врачом центра трансплантации доноров и должны быть признаны подходящими до того, как будет произведена линия.

Линии ЦТЛ: мы будем использовать специфические для тривируса линии ЦТЛ, созданные, как описано ранее. Создание тривирус-специфических линий ЦТЛ требует получения нескольких различных компонентов из РВМС. Линия ЦТЛ будет получена из Т-клеток периферической крови донора путем многократной стимуляции антигенпрезентирующими клетками (АПК), презентирующими антигены ЦМВ, ВЭБ и аденовируса, и экспансии интерлейкином-2 (ИЛ-2). АПК, используемые для стимуляции и размножения ЦМВ-специфических Т-клеток, будут получены из мононуклеарных клеток пациента и В-лимфоцитов.

Чтобы инициировать тривирус-специфическую линию CTL, PBMC трансдуцируют аденовирусным вектором (Ad5f35-pp65), экспрессирующим иммунодоминантный антиген CMV, pp65. Моноцитарная фракция РВМС экспрессировала и презентировала пептидные эпитопы CMV-pp65 для ЦМВ-специфичной Т-клеточной фракции РВМС, в то время как вирионные белки из аденовирусного вектора подвергались процессингу и представлялись аденовирус-специфичной Т-клеточной фракции.

Для размножения тривирус-специфических Т-клеток мы использовали EBV-трансформированные линии В-лимфобластоидных клеток (EBV-LCL), трансдуцированные Ad5f35-pp65. Эта трансдукция позволяет EBV-LCL презентовать пептиды вириона CMV-pp65 и аденовируса Т-клеткам, а также эндогенно экспрессируемые антигены EBV.

EBV-LCL получают из лимфоцитов PBMC-B путем инфицирования лабораторным штаммом вируса Эпштейна-Барр (EBV) клинического уровня. Для получения EBV-LCL требуется около 5 x 10 ^ 6 PBMC или от 5 до 10 мл крови.

В конце периода культивирования ЦТЛ определяли частоту Т-клеток, специфичных для каждого вируса, с использованием тетрамерных реагентов, если они были доступны. Чтобы протестировать функциональную антигенную специфичность ЦТЛ, мы будем использовать библиотеки перекрывающихся пептидов для pp65 и аденовирусного гексона, а также аутологичные и аллогенные LCL в анализах Elispot, и мы будем проводить анализы цитотоксичности с использованием немодифицированных бластов PHA и LCL, нетрансдуцированных или трансдуцированных с помощью Adhexon и CMVpp65 pepmix ИЛИ LCL. преобразован с помощью Ad5f35-null и Ad5f35-pp65. Аликвоты некоторых линий будут отправлены для дальнейшей характеристики в NIH, где доктора Меленхорст и Барретт разрабатывают тесты для прогнозирования аллореактивности, где они исследуют антиген-специфические Т-клетки вируса, используя обширную панель активированных Т-клеток в качестве антигенпрезентирующих клеток (T-APC). Эти строки будут помечены только номером компонента и не будут иметь идентификаторов субъекта.

Линии ЦТЛ также будут проверены на идентичность, фенотип и стерильность и подвергнуты криоконсервации перед введением в соответствии с СОП. Критерии выдачи для введения ЦТЛ пациентам включают жизнеспособность >70%, отрицательный результат посева на бактерии и грибы в течение как минимум 7 дней, тест на эндотоксины менее или равный 5EU/мл, отрицательный результат на микоплазму, <2% CD19-положительных В-клеток, <2% CD14-положительных моноцитов (или <2% CD83-положительных клеток, если дендритные клетки использовались в качестве стимуляторов) и идентичность HLA.

Нет доступной соответствующей линии ЦТЛ: Если нет доступной соответствующей линии, пациент будет зарегистрирован, чтобы можно было оценить осуществимость подхода, а также будет собран конечный результат.

Линия CTL доступна, но статус пациента изменился: клиническое течение пациента, у которого произошли изменения между скринингом и инфузией, не получит CTL, и за ним будет наблюдаться конечный результат.

Данные о выживаемости будут собираться путем обращения к центру трансплантации с просьбой представить стандартную форму основных данных о трансплантации, которая отправляется в базу данных результатов трансплантации стволовых клеток через 100 дней и 1 год и включает данные о статусе выживания и другие показатели результатов.

Критерии выбора линии ЦТЛ: Обычно выбирают линию, совпадающую с наибольшим числом локусов HLA. Совпадение на уровне аллелей будет предпочтительным, но допустим уровень антигена или HLA-A и HLA-B. Однако внимание также будет уделяться типу инфекции и активности линии против этого вируса. Например, для пациента с аденовирусной инфекцией линия, совпадающая по 2 локусам, но имеющая распознавание аденовируса, опосредованное этими антигенами, будет предпочтительнее, чем линия, совпадающая по 3 локусам, но не проявляющая активности против аденовируса. Ведущий протокола обсудит каждый случай с главными исследователями в каждом центре, чтобы определить оптимальную линию ЦТЛ для каждого пациента. Если совпадают более одной строки и недостаточно ячеек для покрытия дополнительных инфузий, вторая линия CTL будет зарезервирована на случай, если дополнительные инфузии потребуются. Пациенты с частичным ответом имеют право на получение дополнительной дозы.

Премедикация: Пациентам будет проведена премедикация Бенадрилом 1 мг/кг (максимум 50 мг) внутривенно и тайленолом 10 мг/кг (максимум 650 мг) перорально.

Пациенты будут находиться под наблюдением в соответствии с институциональными стандартами для введения продуктов крови и, как минимум, будут контролироваться в соответствии со следующим: • Пациенты должны оставаться в клинике не менее одного часа • Пациенты должны оставаться на непрерывном пульсоксиметре не менее 30 минут • В конце инфузии, а затем через 30 и 60 минут необходимо контролировать основные показатели жизнедеятельности.

Поддерживающая терапия: пациенты будут получать поддерживающую терапию при острой или хронической токсичности, включая компоненты крови или антибиотики, а также другие вмешательства по мере необходимости.

Если у пациента наблюдается частичный ответ, он имеет право на получение до 4 дополнительных доз с минимальным интервалом в 2 недели, и если он соответствует критериям приемлемости для последующих линий. Эти дозы будут поступать из исходной инфузионной линии, если в наличии имеется достаточное количество флаконов, но могут поступать из другой линии, если в исходной линии недостаточно клеток.

Последующие оценки: время последующих посещений зависит от даты инфузии ЦТЛ. Если пациент получил несколько доз ЦТЛ, график снова сбрасывается в начале, поэтому последующее наблюдение относится к последней дозе ЦТЛ.

Последующее наблюдение будет происходить через 7 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней, 42 дня, 90 дней, 180 дней и 365 дней (+/- 2 дня до 8-й недели и +/- 14 дней для 90-го дня). 120 и +/- 28 дней в течение 6 и 12 месяцев после регистрации..)

Следующие оценки считаются стандартом медицинской помощи, если они не отмечены ниже знаком «*»:

Перед инфузией: 1. Анамнез и физикальное обследование, включая рост и вес 2. Вирусная нагрузка на ВЭБ, аденовирус, ЦМВ 3. Биопсия места заболевания, если необходимо 4. Визуализирующие исследования, если необходимо 5. Полная информация о стадии и степени острой РТПХ, включая оценки сыпи, диареи, тошноты/рвоты, массы тела и функциональных проб печени 6. Общий анализ крови с дифференциалом, количество тромбоцитов 7. Печеночные пробы (билирубин, щелочная фосфатаза, АСТ, АЛТ) плюс креатинин 8. Уровень такролимуса/циклоспорина 9. * Образцы для лабораторные исследования

После инфузии: 1. Вирусная нагрузка для ЦМВ, ВЭБ, аденовируса еженедельно в 1, 2, 3, 4 и 6 недель и 3, 6 и 12 месяцев. 2. Полная информация о стадии и классификации острой РТПХ, включая оценку сыпи, диареи, тошноты/рвоты, массы тела и функциональных проб печени еженедельно до 45-го дня. 3. Оценка хронической РТПХ (если имеется) через 3, 6, 9 и 12 месяцев. с дифференциалом и подсчетом тромбоцитов через 1, 2, 3, 4 и 6 недель. 5. Инфузионная токсичность в течение 24 часов и оценка токсичности еженедельно до 30-го дня и острая РТПХ до 45-го дня 6. Доза стероидов еженедельно до 42-го дня и 3, 6 и 9 месяцев 7. * Образцы для лабораторных исследований в дни 0, 14, 28 и 90 8. Инфекции через 42 дня и в 3, 6 и 12 месяцев

Дополнительные лабораторные исследования будут включать: 1) Оценка вирусспецифического иммунитета на основе уровней ЦТЛ, измеренных с помощью анализов ELISPOT или анализов тетрамеров. 2) Персистенция инфузированных Т-клеток на основе ПЦР для нераспространяемого антигена.

Сообщение о смерти пациента: Информация о смерти получателя должна быть введена в веб-систему ввода данных в течение 24 часов после того, как стало известно о смерти пациента. Если в то время причина смерти неизвестна, тогда ее не нужно регистрировать. Однако после установления причины смерти форма должна быть обновлена.

Оценка донора: - Полный анамнез и физикальное обследование - Общий анализ крови, тромбоциты, дифференциальный анализ - Общий белок, альбумин, общий билирубин, щелочная фосфатаза, АЛТ, АСТ, - Антитела к ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-2, NAT ВИЧ, HTLV-1/2 антитела, HBsantigen, антитела HBc, NAT HCV, антитела CMV, RPR, NAT вируса Западного Нила и тестирование Шагаса - ABO и резус-типирование - Когда оценка будет завершена, врач-трансплантолог отметит в медицинских записях реципиента и донора, что тесты были оценены, и донор является приемлемым.