Skuteczność kliniczna żelu płytkowego z krwi pępowinowej w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej (CBPG-DFU)

Informacje ogólne i uzasadnienie badania: Dowód nr. 1 (żel płytkowy). Żel uzyskany w wyniku aktywacji płytek osocza bogatopłytkowego za pomocą trombiny lub farmaceutycznych ekstraktów z jadu kobry jest składnikiem krwi stosowanym klinicznie od wielu lat. Uzasadnieniem przemawiającym za tą terapią jest wysoka zawartość czynników wzrostu w granulkach płytkowych alfa, które mogą być dostarczane miejscowo przez naturalny biokompatybilny nośnik (tj. płytki krwi) po aktywacji płytek krwi. Do tej pory żel płytkowy był stosowany głównie do naprawy opornych owrzodzeń skóry u pacjentów z cukrzycą i bez cukrzycy w warunkach autologicznego oddawania krwi. Niestety większość kandydatów do tej terapii to pacjenci w podeszłym wieku, często z szeregiem stanów patologicznych i chorób współistniejących, które w większości czynią ich niezdolnymi lub nieprzydatnymi do procesu pobrania krwi autologicznej. W praktyce większość pacjentów, którzy mogliby odnieść największe korzyści z tej terapii, jest de facto pozbawiona potencjalnie skutecznego leczenia z powodu tego ograniczenia.

Dowód nr. 2 (bezpieczeństwo transfuzji krwi). Obecne systemy badań przesiewowych dawców krwi za pomocą testów wirusowych kwasów nukleinowych radykalnie zmniejszyły ryzyko przeniesienia chorób zakaźnych poprzez transfuzję krwi i składników krwi. W związku z tym ograniczenia stosowania krwi allogenicznej i składników krwi, które były obowiązkowe kilkadziesiąt lat temu, nie znajdują obecnie uzasadnienia. Otwiera to perspektywę zwiększonego wykorzystania allogenicznych składników krwi - w tym żelu płytkowego - z potencjalnymi korzyściami dla dużej liczby pacjentów, u których są one najczęściej wskazane.

Dowód nr. 3 (żel płytkowy z krwi pępowinowej). Grupa badawcza kierowana przez badacza proponującego niniejszy projekt opracowała ostatnio nowatorską metodę (PCT nr. WO 2010/007502 A2, 21 stycznia 2010) w celu uzyskania żelu płytkowego z krwi noworodka pozostałej w łożysku po porodzie, czyli krwi pępowinowej lub krwi łożyskowej. Główne dotychczas stwierdzone zalety żelu płytkowego pochodzącego z płytek krwi pępowinowej w porównaniu z żelem płytkowym pochodzącym z dorosłych płytek krwi dotyczą braku zanieczyszczenia mikrobiologicznego w tym pierwszym oraz innego profilu stężeń czynników wzrostu, przy czym główna różnica polega na wyższym zawartość VEGF i niższą zawartość TGF w żelu płytek krwi pępowinowej. Wprowadzone ostatnio modyfikacje doprowadziły do ​​procedury, w której żel płytkowy z krwi pępowinowej można przygotowywać i przechowywać w małej plastikowej torebce zamiast w probówkach lub naczyniach, które można łatwo kriokonserwować, przechowywać, transportować do miejsc zastosowania klinicznego i nakładać na owrzodzenie skóry bez przerywania łańcucha sterylności. Otwiera to drogę do szerszego zastosowania allogenicznego żelu płytek krwi pępowinowej w szpitalach i poza nimi.

Dowód nr. 4 (luki w wiedzy). Pomimo interesujących i obiecujących wyników na allogenicznym żelu płytek krwi pępowinowej, brakuje trzech elementów, zanim ten ostatni będzie mógł być szeroko stosowany u pacjentów, którzy mogą go potrzebować: (1) pełniejsza charakterystyka biochemiczna; (2) regionalny lub krajowy program zbierania i przygotowywania niezbędnych dawek żelu płytek krwi pępowinowej; (3) randomizowane badanie kliniczne o mocy statystycznej wystarczającej do wykrycia znaczących korzyści (zarówno klinicznych, jak i ekonomicznych) u pacjentów leczonych żelem płytek krwi pępowinowej w porównaniu z grupą kontrolną leczoną zaawansowanymi lekami przeciwwrzodowymi. W tym względzie badania na małą skalę sugerują, że skuteczne stosowanie żelu płytkowego może zmniejszyć koszty leczenia opornych owrzodzeń skóry do jednej dziesiątej kosztów obecnie zwracanych szpitalom za nieskuteczne zaawansowane leki (z około 190 000 euro do około 19 000 euro na leczenie 11 starszych pacjentów). .

Dowód nr. 5 (bankowanie i przeszczep krwi pępowinowej). Krew pępowinowa – niegdyś utylizowana jako odpad szpitalny – jest obecnie cennym źródłem hemopoetycznych komórek macierzystych do wymiany szpiku kostnego u pacjentów dotkniętych ciężkimi chorobami krwi. Ostatnie 25 lat doświadczenia klinicznego z tym źródłem komórek macierzystych pokazało, że wysoka dawka komórek i lepsze dopasowanie HLA to najważniejsze czynniki wpływające na przeżycie pacjenta. Z tego powodu banki krwi pępowinowej preferują kriokonserwację jednostek krwi pępowinowej o bardzo dużych objętościach, ponieważ objętość koreluje z zawartością komórek, i odrzucają około trzech czwartych zebranych jednostek. Oczekuje się, że wskaźnik odrzutów wzrośnie w przyszłości, również dlatego, że światowe zapasy około 600 000 jednostek krwi pępowinowej w 128 bankach krwi pępowinowej obejmują już jednostki o objętościach, które są obecnie uważane za suboptymalne dla przeszczepów układu krwiotwórczego. Oczekuje się zatem, że 70-80% jednostek krwi pępowinowej oddanych do allogenicznego przeszczepu układu krwiotwórczego może nie nadawać się do tego zastosowania i ostatecznie zostać wyrzuconych. Jednostki te mogą być użyte do przygotowania żelu płytkowego, jeśli zostanie opracowany odpowiedni program odzyskiwania z bloków porodowych, transportu do miejsca produkcji i przetwarzania w żel płytkowy.

Projekt badania: To badanie jest wieloośrodkowym, kontrolowanym, randomizowanym badaniem klinicznym (alogeniczny żel płytkowy z krwi pępowinowej (CBPG) w porównaniu ze standardowymi lekami miejscowymi (SLM)). Każde centrum kliniczne zostało poproszone o włączenie 15 leczonych i 15 kontrolnych pacjentów, zgodnie z lokalną dostępnością w 12-miesięcznym okresie badania.

Obliczenie wielkości próby: 95 + 5 (rezygnacja) i 95 + 5 (rezygnacja) grupa kontrolna zapewniają 80% mocy wykrywania jako statystycznie istotne (p<0,05) >60% wyleczenia w teście vs 40% wyleczenia w grupie kontrolnej (Pocock, 1983).

Zasady analizy statystycznej: Statystyki opisowe: tabele zbiorcze według grup terapeutycznych (z wyjątkiem podstawowych cech charakterystycznych, które zostaną dostarczone według sekwencji i ogółem) zgodnie z rodzajem sumarycznej zmiennej; kryteria ilościowe: standardowe statystyki ilościowe (N, średnia, SD, mediana, min-max); kryteria jakościowe: rozkład częstości [liczba obserwacji niebrakujących (N) i procenty (%)].

Przygotowanie CBPG i kontrola jakości: jednostki CB są rutynowo pobierane po uzyskaniu świadomej zgody matki do plastikowych torebek zawierających 21-29 ml antykoagulantu cytrynianowo-fosforanowo-dekstrozowego (CPD) przez przeszkolone położne, odpowiednio przed i po porodzie łożyska w przypadku porodu naturalnego i cięcia cesarskiego , zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi standardowymi procedurami operacyjnymi, w akredytowanych publicznych bankach krwi pępowinowej należących do Włoskiej Sieci Krwi Pępowinowej koordynowanej przez Centro Nazionale Sangue. Po przechowywaniu i transporcie w monitorowanej temperaturze pokojowej jednostki będą przetwarzane w celu przygotowania CBPG w ciągu 48 godzin od pobrania. W oparciu o wcześniejsze działania standaryzacyjne, uczestniczące banki będą mogły używać lokalnie dostępnych toreb o dogodnym rozmiarze i nominalnej objętości, które uznają za odpowiednie dla tego protokołu. W powyższym ćwiczeniu standaryzacyjnym postanowiono zdefiniować główne cechy ostatecznego CBPC w następujący sposób: docelowa średnia objętość 10 ml, zakres 5-15; docelowe średnie stężenie płytek krwi 1 x 109/l, zakres 0,8 - 1,2 x 109/l. To ostatnie stężenie wybrano zgodnie ze stężeniem płytek krwi określonym przez Włoskie Towarzystwo Medycyny Transfuzjologicznej dla żelu płytkowego otrzymanego z krwi dorosłego. CBPG zostanie przygotowany zgodnie z procedurami określonymi podczas badań pilotażowych w każdym banku, które obejmowały wstępne odwirowanie CB przy 200-210 g x 10-15 minut, następnie przeniesienie osocza bogatopłytkowego (PRP) do worka wtórnego, odwirowanie PRP przy 1800-2600 g x 15 minut i usunięcie supernatantu osocza ubogiego w płytki krwi (PPP) w ilości przekraczającej końcową docelową objętość CBPC. Ta ostatnia została zdefiniowana za pomocą zautomatyzowanego algorytmu wykonanego przez arkusz kalkulacyjny Excel służący do zbierania danych, który uwzględnia stężenie płytek krwi w PRP oraz minimalną (0,8 x 109/l) i maksymalną (1,2 x 109/l) wartość docelowe stężenie płytek krwi w końcowym CBPC. Stężenia płytek krwi w PRP podzielone przez 0,8 i 1,2 x 109/l wyznaczają odpowiednio górną i dolną granicę objętości CBPC. Końcową objętość ustalono przez określenie masy netto CBPC na wadze elektronicznej. Jednostki CBPC zostaną ostatecznie poddane kriokonserwacji w zamrażarce mechanicznej w temperaturze -80°C w celu zastosowania klinicznego CBPG, co będzie wymagało rozmrożenia w temperaturze 37°C w łaźni wodnej i aktywacji glukonianem wapnia. W przypadku standardowych leków lokalnych każdy ośrodek kliniczny będzie stosował zatwierdzone standardowe leki lokalne. Szczegóły i specyfikacje lokalnych standardowych procedur leczenia zostaną zebrane z każdego uczestniczącego ośrodka.

Zabiegi: Zabiegi testowe: CBPG to żel utworzony przez fibrynę wychwytującą fragmenty płytek krwi z około 10 miliardów płytek krwi w 10 ml osocza noworodków antykoagulowanego CPD. Jest przechowywany w handlowej torbie z PVC do przygotowania i przechowywania składników krwi.

W latach 80. David Knighton opracował technikę stymulacji płytek krwi in vitro roztworami trombiny, które pozwoliły na zebranie supernatantu bogatego w czynniki wzrostu. Ten produkt, pochodzący z płytek krwi pacjenta, był nakładany miejscowo w postaci żelu, aby przyspieszyć gojenie się owrzodzeń.

Uzasadnieniem stosowania takiego produktu jest obecność kilku tkankowych czynników wzrostu: P.D.G.F. (Płytkowy czynnik wzrostu); EGF (naskórkowy czynnik wzrostu); TGF (Transformujący czynnik wzrostu); VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego); IGF 1 e 2 (czynnik wzrostu insuliny 1 i 2); FGF (czynnik wzrostu fibroblastów). Zastosowanie in situ skoncentrowanych i aktywowanych płytek krwi w postaci żelu płytkowego uruchamia i przyspiesza procesy regeneracji tkanek. W tym ustawieniu płytki krwi są podobne do komórkowych zbiorników laboratoryjnych, które przetwarzają, przechowują, a następnie uwalniają (jeśli są aktywowane) kilka czynników wzrostu zdolnych do stymulowania regeneracji mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak fibroblasty, osteoblasty i komórki śródbłonka. Ta zdolność płytek krwi do udziału w mechanizmach naprawy tkanek była teoretycznym zasadniczym wymogiem stosowania żelu płytkowego w kilku przypadkach, z których wszystkie były związane z wymogiem aktywacji naprawy tkanek.

Wykazano, że wielokrotne aplikacje PG są przydatne przed operacją rany, ponieważ mogą zmniejszyć rozmiar zmiany, poprawić warunki anatomiczne i morfologiczne łożyska rany i brzegów oraz wywołać neoangiogenezę na brzegach iw obszarze martwicy.

Zwykłym źródłem frakcji płytek krwi jest dorosła ludzka krew, ale to źródło wiąże się z istotnymi wadami i problemami. Krew obwodowa człowieka nie może być wykorzystana bez potencjalnego ryzyka związanego z alloreaktywnością, co skutkuje kilkoma powikłaniami klinicznymi. Z drugiej strony dostępność krwi autologicznej jest ogólnie niska, ponieważ pobranie wystarczającej ilości krwi od pacjenta, który nie toleruje takiego odstawienia, może być niebezpieczne. Ponadto krew allogeniczna od dorosłych dawców może wiązać się z ryzykiem infekcji.

Frakcje płytek krwi pochodzące z ludzkiej krwi łożyskowej mogą uniknąć powyższych wad, a także zawierają wysokie stężenia czynników płytkowych.

Dawkowanie i podawanie: W przypadku leczenia pacjentów włączonych do ramienia leczenia, jedna jednostka CBPG (średnia objętość 10 ml, zakres 5-15; średnie stężenie płytek krwi 1 x 109/l (0,8 - 1,2 x 109/l) będzie podawana co 3-4 dni. Jednostki CBPG, kriokonserwowane i przechowywane w małej plastikowej torebce w zamrażarce w temperaturze -80°C, zostaną rozmrożone w temperaturze 37°C w łaźni wodnej i aktywowane glukonianem wapnia i natychmiast przetransportowane do miejsc zastosowania klinicznego i zastosowane na owrzodzenie skóry bez rozbijania łańcuch sterylności.

Ocena skuteczności: Skuteczność zostanie oceniona za pomocą formularza badań klinicznych CBPG-DFU.

Ocena bezpieczeństwa: Zostaną zebrane informacje o wszystkich zdarzeniach niepożądanych i zdarzeniach związanych z CBPG, które wystąpią podczas leczenia. Działania związane z opieką i postępowaniem podczas każdej wizyty leczniczej będą obejmować oczyszczenie i ocenę rany oraz uzyskanie parametrów życiowych i historii rany, w tym informacji dotyczących zdarzeń niepożądanych, jednocześnie stosowanych leków, stanu odżywienia i masy ciała.