脐带血血小板凝胶治疗糖尿病足溃疡的临床疗效 (CBPG-DFU)

背景资料和研究理由：证据编号。 1（血小板凝胶）。 用凝血酶或用眼镜蛇毒的药物提取物对富含血小板的血浆进行血小板活化后获得的凝胶是一种血液成分，多年来一直用于临床目的。 支持该疗法的基本原理与血小板 α 颗粒中高含量的生长因子有关，血小板活化后可以通过天然生物相容性载体（即血小板）局部递送。 到目前为止，血小板凝胶主要用于在自体献血环境中修复糖尿病和非糖尿病患者的顽固性皮肤溃疡。 不幸的是，这种疗法的大多数候选者都是老年患者，他们经常受到许多病理状况和合并症的影响，这使得他们大多不适合或不适合自体血液采集过程。 实际上，由于这种限制，大多数本来可以从这种疗法中获益最多的患者实际上被剥夺了可能有效的治疗。

证据编号2（输血安全）。 目前通过病毒核酸检测进行献血者筛查的系统大大降低了通过输血和血液成分传播传染病的风险。 因此，几十年前强制使用同种异体血液和血液成分的限制目前没有理由。 这开启了增加使用同种异体血液成分（包括血小板凝胶）的前景，这对大多数需要它们的患者具有潜在优势。

证据编号3（来自脐带血的血小板凝胶）。 由提出本项目的研究者领导的一个研究小组最近开发了一种新方法（PCT 号： WO 2010/007502 A2，2010 年 1 月 21 日）从分娩后残留在胎盘中的新生儿血液（又称脐带血或胎盘血）中获取血小板凝胶。 迄今为止，与成人血小板衍生的血小板凝胶相比，脐带血血小板衍生的血小板凝胶的主要优势在于前者没有微生物污染和不同的生长因子浓度分布，主要区别在于更高的脐血血小板凝胶中 VEGF 含量和 TGF 含量较低。 最近进行的修改导致了一种程序，其中可以从脐带血中制备血小板凝胶并将其储存在一个小塑料袋中，而不是在管或盘中，它可以很容易地冷冻保存、储存、运输到临床使用场所并应用于皮肤溃疡而不破坏不育链。 这为在医院内外更广泛地使用同种异体脐带血血小板凝胶铺平了道路。

证据编号4（知识差距）。 尽管同种异体脐带血血小板凝胶取得了有趣且有希望的结果，但在后者可能广泛用于可能需要它的患者之前，还缺少三个要素：(1) 更完整的生化表征； (2) 收集和制备必要剂量的脐带血血小板凝胶的区域或国家计划； (3) 一项具有足够统计功效的随机临床试验，可以检测到接受脐带血血小板凝胶治疗的患者与接受皮肤溃疡晚期药物治疗的对照组相比具有显着优势（临床和经济）。 在这方面，小规模调查表明，有效使用血小板凝胶可以将顽固性皮肤溃疡的药物成本降低到目前向医院报销的无效高级药物费用的十分之一（从约 190.000 欧元减少到约 19.000 欧元，用于治疗 11 名老年患者） .

证据编号5（脐带血库和移植）。 脐带血——曾经被当作医院废物处理——目前是造血干细胞的宝贵来源，可用于严重血液病患者的骨髓替代。 过去 25 年的这种干细胞来源的临床经验表明，高细胞剂量和更好的 HLA 匹配是影响患者生存的最重要因素。 出于这个原因，脐带血库优先冷冻保存体积非常大的脐带血单位，因为体积与细胞含量相关，并丢弃大约四分之三的收集单位。 预计未来丢弃率会增加，这也是因为 128 个脐带血库中约 600.000 个脐带血的全球库存已经包括目前被认为不适合造血移植的数量的单位。 因此，预计 70-80% 的捐赠用于同种异体造血移植的脐带血单位可能不适合这种用途并最终被丢弃。 如果制定了从产房回收、运输到生产现场和加工成血小板凝胶的合适程序，这些装置可用于制备血小板凝胶。

研究设计：本研究是一项多中心对照随机临床试验（同种异体脐带血血小板凝胶 (CBPG) 与标准局部药物 (SLM)）。 根据 12 个月研究间隔内的当地可用性，每个临床中心都被邀请招募 15 名接受治疗的患者和 15 名对照患者。

样本量计算：95 + 5（辍学）测试和 95 + 5（辍学）对照患者确保 80% 的检测能力具有统计学意义（p<0.05） 测试中 >60% 的愈合与对照中 40% 的愈合相比（Pocock，1983）。

统计分析原则： 描述性统计：根据汇总的变量类型，按治疗组汇总表（除基线特征外，将按序列和总体提供）；定量标准：标准定量统计（N、平均值、SD、中值、最小值-最大值）；定性标准：频率分布 [非缺失观察值的数量 (N) 和百分比 (%)]。

CBPG 制备和质量控制：CB 单位在母亲知情同意后，由受过训练的助产士在含有 21-29 mL 柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖 (CPD) 抗凝剂的塑料袋中定期收集，分别在自然分娩和剖宫产的胎盘分娩前后，根据当地验证的标准操作程序，在属于 Centro Nazionale Sangue 协调的意大利脐带血网络的认可公共脐带血库中。 在监测室温下储存和运输后，将在收集后 48 小时内处理这些单位以制备 CBPG。 根据之前的标准化工作，参与的银行将被允许使用他们认为适合该协议的当地可用的方便尺寸和标称体积的袋子。 在上述标准化工作中，决定将最终 CBPC 的主要特征定义如下：目标平均体积 10 毫升，范围 5-15；目标平均血小板浓度 1 x 109/L，范围 0.8 - 1.2 x 109/L。 后一种浓度的选择与意大利输血医学协会为从成人血液中获得的血小板凝胶定义的血小板浓度一致。 CBPG 将根据每个银行的试点研究期间定义的程序准备，其中包括以 200-210 g x 10-15 分钟对 CB 进行初始离心，然后将富含血小板的血浆 (PRP) 转移到二级袋中，离心PRP 在 1800-2600 g x 15 分钟，并去除超过 CBPC 最终目标体积的上清液贫血小板血浆 (PPP)。 后者由用于数据收集的 Excel 电子表格执行的自动算法定义，该算法考虑了 PRP 中的血小板浓度以及 PRP 的最小值 (0.8 x 109/L) 和最大值 (1.2 x 109/L)最终 CBPC 中的血小板浓度。 PRP 中的血小板浓度除以 0.8 和 1.2 x 109/L 分别提供 CBPC 体积的上限和下限。 通过在电子秤上确定 CBPC 的净重来设置最终体积。 鉴于 CBPG 的临床使用，CBPC 单元最终将冷冻保存在 -80°C 的机械冰箱中，这将需要在 37°C 的水浴中解冻并用葡萄糖酸钙激活。 对于标准的当地药物，每个临床中心将使用他们经过验证的标准当地药物。 将从每个参与中心收集当地标准药物程序的详细信息和规格。

治疗： 测试治疗：CBPG 是一种凝胶，由纤维蛋白捕获来自 10 mL 用 CPD 抗凝的新生儿血浆中约 100 亿个血小板的血小板碎片形成。 它储存在商业 PVC 袋中，用于血液成分的制备和储存。

在 80 年代，David Knighton 开发了一种体外刺激血小板的技术，使用凝血酶溶液可以收集富含生长因子的上清液。 这种源自患者血小板的产品被局部用作凝胶以促进溃疡修复。

使用此类产品的基本原理是存在多种组织生长因子：P.D.G.F. （血小板衍生生长因子）； E.G.F. （表皮生长因子）； T.G.F. （转化生长因子）； V.E.G.F. （血管内皮生长因子）； I.G.F. 1 e 2（胰岛素生长因子 1 和 2）； F.G.F. （成纤维细胞生长因子）。 原位应用浓缩和活化的血小板作为血小板凝胶，组织再生过程开始并加速。 在这种情况下，血小板类似于细胞实验室罐，处理、储存然后释放（如果被激活）几种能够刺激间充质干细胞再生的生长因子，如成纤维细胞、成骨细胞和内皮细胞。 这种参与组织修复机制的血小板能力是在多种情况下使用血小板凝胶的理论基本要求，所有这些都与组织修复激活的要求有关。

已证明在伤口手术前重复应用 PG 是有用的，因为它们可以减小病变大小，改善伤口床和边缘的解剖学和形态学状况，并在边缘和坏死区域内触发新血管生成。

血小板部分的通常来源是成人血液，但这种来源涉及相关的缺点和问题。 由于同种异体反应，不能在没有潜在风险的情况下使用来自人类的外周血，从而导致多种临床并发症。 另一方面，自体血液的可用性通常很低，因为从不能耐受这种抽取的患者身上抽取足够的量可能是危险的。 此外，来自成人捐献者的同种异体血液可能存在感染风险。

源自人胎盘血的血小板组分可以避免上述缺点并且还含有高浓度的血小板因子。

剂量和给药：对于参加治疗组的患者的药物治疗，将每3-4 天。 CBPG 单位，冷冻保存并储存在 -80°C 冰箱中的小塑料袋中，将在 37°C 水浴中解冻并用葡萄糖酸钙激活，并立即运送到临床使用部位并应用于皮肤溃疡而不破裂不育链。

疗效评估：将使用 CBPG-DFU 临床研究表评估疗效。

安全性评估：将收集有关所有不良事件以及与治疗期间发生的 CBPG 相关的事件的信息。 每次就诊时提供的护理和管理工作将包括清洁和评估伤口以及获取生命体征和临时伤口病史，包括有关不良事件、伴随药物、营养和负重状态的信息。