Klinická účinnost destičkového gelu z pupečníkové krve pro léčbu vředů diabetické nohy (CBPG-DFU)

Základní informace a zdůvodnění studie: Důkaz č. 1 (destičkový gel). Gel získaný po aktivaci plazmy bohaté na krevní destičky trombinem nebo farmaceutickými extrakty z kobřího jedu je krevní složkou, která se používá pro klinické účely již řadu let. Důvod podporující tuto terapii se týká vysokého obsahu růstových faktorů v destičkových alfa granulích, které mohou být dodávány lokálně přirozeným biokompatibilním nosičem (tj. destičkami) po aktivaci destiček. Dosud se gel na krevní destičky používal hlavně k opravě odolných kožních vředů u diabetických a nediabetických pacientů v rámci autologního dárcovství krve. Bohužel většina kandidátů na tuto terapii jsou starší pacienti, často postižení řadou patologických stavů a ​​komorbidit, které je většinou činí nevhodnými nebo nevhodnými pro proces autologního odběru krve. V praxi je většina pacientů, kteří by mohli z této terapie většinou profitovat, de facto kvůli tomuto omezení připravena o potenciálně účinnou léčbu.

Důkaz č. 2 (bezpečnost krevní transfuze). Současné systémy pro screening dárců krve testováním virových nukleových kyselin dramaticky snížily riziko přenosu infekčních stavů transfuzí krve a krevních složek. Omezení použití alogenní krve a krevních složek, které bylo povinné před několika desítkami let, tedy nenachází současné opodstatnění. To otevírá perspektivu zvýšeného používání alogenních krevních složek – včetně destičkového gelu – s potenciálními výhodami pro velký počet pacientů, u kterých jsou většinou indikovány.

Důkaz č. 3 (destičkový gel z pupečníkové krve). Výzkumná skupina vedená řešitelem navrhujícím tento projekt nedávno vyvinula novou metodu (PCT č. WO 2010/007502 A2, 21. ledna 2010) k získání destičkového gelu z krve novorozence, která zůstala v placentě po porodu, neboli pupečníkové krve nebo placentární krve. Hlavní výhody dosud identifikované u destičkového gelu získaného z krevních destiček z pupečníkové krve ve srovnání s destičkovým gelem odvozeným z krevních destiček dospělých se týkají nedostatku mikrobiologické kontaminace v prvním případě a odlišného profilu koncentrací růstových faktorů, přičemž hlavní rozdíl spočívá ve vyšší obsah VEGF a nižší obsah TGF v gelu na krevní destičky z pupečníkové krve. Nedávné provedené úpravy vedly k postupu, při kterém lze destičkový gel z pupečníkové krve připravit a skladovat v malém plastovém sáčku spíše než ve zkumavkách nebo miskách, které lze snadno kryokonzervovat, skladovat, přepravovat na místa klinického použití a aplikovat na kožní vřed bez přerušení řetězce sterility. To otevírá cestu pro širší použití alogenního gelu na krevní destičky z pupečníkové krve v nemocnicích i mimo ně.

Důkaz č. 4 (mezery ve znalostech). Navzdory zajímavým a slibným výsledkům na alogenním gelu na krevní destičky z pupečníkové krve chybí tři prvky, než by mohl být posledně jmenovaný široce používán u pacientů, kteří to mohou potřebovat: (1) úplnější biochemická charakterizace; (2) regionální nebo národní program pro odběr a přípravu nezbytných dávek gelu na krevní destičky z pupečníkové krve; (3) randomizovaná klinická studie s dostatečnou statistickou silou k odhalení významných výhod (klinických i ekonomických) u pacientů léčených gelem na krevní destičky z pupečníkové krve oproti kontrolám léčeným pokročilými léky na kožní vředy. V tomto ohledu výzkumy malého rozsahu naznačují, že účinné používání gelu na krevní destičky může snížit náklady na léčbu vzdorovitých kožních vředů na jednu desetinu nákladů, které jsou v současnosti propláceny nemocnicím za neúčinnou moderní léčbu (z přibližně 190 000 EUR na přibližně 19 000 EUR na léčbu 11 starších pacientů) .

Důkaz č. 5 (bankovnictví a transplantace pupečníkové krve). Pupečníková krev – která byla kdysi likvidována jako nemocniční odpad – je v současnosti vzácným zdrojem hemopoetických kmenových buněk, které se používají k náhradě kostní dřeně u pacientů postižených závažnými krevními chorobami. Posledních 25 let klinických zkušeností s tímto zdrojem kmenových buněk ukázalo, že vysoká dávka buněk a lepší shoda HLA jsou nejdůležitějšími faktory ovlivňujícími přežití pacientů. Z tohoto důvodu banky pupečníkové krve přednostně kryokonzervují jednotky pupečníkové krve s velmi velkými objemy, protože objem koreluje s obsahem buněk, a vyřazují asi tři čtvrtiny odebraných jednotek. Očekává se, že míra vyřazení se v budoucnu zvýší, také proto, že celosvětový inventář asi 600 000 jednotek pupečníkové krve ve 128 bankách pupečníkové krve již zahrnuje jednotky s objemy, které jsou v současnosti považovány za suboptimální pro transplantaci krvetvorby. Proto se očekává, že 70–80 % jednotek pupečníkové krve darovaných pro alogenní transplantaci krvetvorby může být pro toto použití nevhodných a nakonec vyřazeno. Tyto jednotky lze použít pro přípravu destičkového gelu, pokud je vyvinut vhodný program regenerace z aplikačních souprav, přepravy na místo výroby a zpracování na destičkový gel.

Design studie: Tato studie je multicentrická kontrolovaná randomizovaná klinická studie (alogenní gel na krevní destičky z pupečníkové krve (CBPG) vs. standardní lokální léky (SLM)). Každé klinické centrum bylo vyzváno k zařazení 15 léčených a 15 kontrolních pacientů podle místní dostupnosti ve 12měsíčním intervalu studie.

Výpočet velikosti vzorku: 95 + 5 (vynechání) test a 95 + 5 (vynechání) kontrolních pacientů zajišťuje 80% schopnost detekce jako statisticky významné (p<0,05) >60% hojení v testu oproti 40% hojení u kontrol (Pocock, 1983).

Principy statistické analýzy: Popisná statistika: souhrnné tabulky podle léčené skupiny (kromě základních charakteristik, které budou poskytnuty podle pořadí a celkově) podle typu souhrnné proměnné; kvantitativní kritéria: standardní kvantitativní statistika (N, průměr, SD, medián, min-max); kvalitativní kritéria: rozdělení četností [počet nescházejících pozorování (N) a procenta (%)].

Příprava CBPG a kontrola kvality: CB jednotky jsou rutinně odebírány po informovaném souhlasu matky do plastových sáčků obsahujících 21-29 ml citrát-fosfát-dextrózového (CPD) antikoagulantu vyškolenými porodními asistentkami, před a po porodu placenty při přirozeném porodu a při císařském řezu, resp. , podle místně ověřených standardních operačních postupů v akreditovaných veřejných bankách pupečníkové krve patřících do italské sítě pupečníkové krve koordinované Centro Nazionale Sangue. Po skladování a přepravě při monitorované pokojové teplotě budou jednotky zpracovány pro přípravu CBPG do 48 hodin od odběru. Na základě předchozího standardizačního cvičení budou zúčastněné banky moci používat místně dostupné pytle vhodné velikosti a nominálního objemu, které považují za vhodné pro tento protokol. Ve výše uvedeném standardizačním cvičení bylo rozhodnuto definovat hlavní charakteristiky konečného CBPC následovně: cílový střední objem 10 ml, rozmezí 5-15; cílová střední koncentrace trombocytů 1 x 109/l, rozmezí 0,8 - 1,2 x 109/l. Posledně uvedená koncentrace byla zvolena v souladu s koncentrací krevních destiček definovanou Italskou společností transfuzního lékařství pro destičkový gel získaný z krve dospělých. CBPG bude připraven podle postupů definovaných během pilotních studií v každé bance, které zahrnovaly počáteční centrifugaci CB při 200-210 g x 10-15 minut, po níž následoval přenos plazmy bohaté na krevní destičky (PRP) do sekundárního vaku, centrifugace PRP při 1800-2600 g x 15 minut a odstranění supernatantu plazmy chudé na destičky (PPP) nad konečný cílový objem CBPC. Ten byl definován automatickým algoritmem prováděným pomocí excelové tabulky používané pro sběr dat, která bere v úvahu koncentraci krevních destiček v PRP a minimální (0,8 x 109/l) a maximální (1,2 x 109/l) hodnoty koncentrace krevních destiček cílená v konečném CBPC. Koncentrace krevních destiček v PRP dělené 0,8 a 1,2 x 109/l poskytují horní a dolní mez objemu CBPC. Konečný objem byl stanoven stanovením čisté hmotnosti CBPC na elektronické váze. Jednotky CBPC budou nakonec kryokonzervovány v mechanickém mrazáku -80 °C s ohledem na klinické použití CBPG, které bude vyžadovat rozmrazení při 37 °C ve vodní lázni a aktivaci glukonátem vápenatým. Pro standardní místní léky bude každé klinické centrum používat své ověřené standardní místní léky. Podrobnosti a specifikace místních standardních léčebných postupů budou získány z každého zúčastněného centra.

Ošetření: Testovací ošetření: CBPG je gel tvořený fibrinem zachycujícími fragmenty destiček z přibližně 10 miliard destiček v 10 ml novorozenecké plazmy antikoagulované CPD. Je uložen v komerčním PVC sáčku pro přípravu a skladování krevních složek.

V 80. letech David Knighton vyvinul techniku ​​pro stimulaci krevních destiček in vitro pomocí roztoků trombinu, které umožnily shromáždit supernatant bohatý na růstové faktory. Tento produkt získaný z krevních destiček pacienta byl lokálně aplikován jako gel pro podporu hojení vředů.

Důvodem pro použití takového produktu je přítomnost několika tkáňových růstových faktorů: P.D.G.F. (růstový faktor odvozený od krevních destiček); E.G.F. (Epidermální růstový faktor); T.G.F. (Transforming Growth Factor); V.E.G.F. (vaskulární endoteliální růstový faktor); I.G.F. 1 e 2 (inzulínový růstový faktor 1 a 2); F.G.F. (Fibroblastový růstový faktor). Aplikací in situ koncentrovaných a aktivovaných destiček jako destičkového gelu jsou nastartovány a urychleny procesy regenerace tkání. V tomto prostředí jsou krevní destičky podobné buněčným laboratorním nádržím, které zpracovávají, uchovávají a poté uvolňují (pokud jsou aktivovány) několik růstových faktorů schopných stimulovat regeneraci mezenchymálních kmenových buněk, jako jsou fibroblasty, osteoblasty a endoteliální buňky. Tato schopnost krevních destiček účastnit se mechanismů opravy tkáně byla teoretickým základním požadavkem pro použití gelu krevních destiček za několika okolností, všechny spojené s požadavkem aktivace opravy tkáně.

Opakované aplikace PG se ukázaly být užitečné před operací rány, protože mohou snížit velikost lézí, zlepšit anatomické a morfologické podmínky spodiny a okrajů rány a spustit neoangiogenezi na okrajích a v nekrotické oblasti.

Obvyklým zdrojem frakcí krevních destiček je dospělá lidská krev, ale tento zdroj má významné nevýhody a problémy. Periferní krev od člověka nelze použít bez potenciálních rizik kvůli aloreaktivitě, což má za následek několik klinických komplikací. Na druhé straně je dostupnost autologní krve obecně nízká, protože může být nebezpečné odebrat dostatečné množství od pacienta, který takový odběr netoleruje. Navíc alogenní krev od dospělých dárců může zahrnovat riziko infekcí.

Frakce krevních destiček pocházející z lidské placentární krve se mohou vyhnout výše uvedeným nevýhodám a také obsahují vysoké koncentrace destičkových faktorů.

Dávkování a způsob podání: Pro léčbu pacientů zařazených do léčebné větve bude podána jedna jednotka CBPG (průměrný objem 10 ml, rozmezí 5-15; průměrná koncentrace krevních destiček 1 x 109/l (0,8 - 1,2 x 109/l) 3-4 dny. Jednotky CBPG, kryokonzervované a skladované v malém plastovém sáčku v mrazáku -80 °C, budou rozmraženy při 37 °C ve vodní lázni a aktivovány glukonátem vápenatým a okamžitě převezeny na místa klinického použití a aplikovány na kožní vřed bez porušení řetězec sterility.

Hodnocení účinnosti: Účinnost bude hodnocena pomocí formuláře klinického výzkumu CBPG-DFU.

Hodnocení bezpečnosti: Budou shromažďovány informace o všech nežádoucích příhodách a příhodách spojených s CBPG, které se vyskytnou během léčby. Péče a management poskytované při každé léčebné návštěvě budou zahrnovat čištění a zhodnocení rány a získání vitálních funkcí a prozatímní anamnézy rány, včetně informací o nežádoucích účincích, souběžných lécích, výživě a stavu nosnosti.