Methyl-qPCR: nowy marker predykcyjny dla proliferacji limfatycznej związanej z wirusem Epsteina-Barra podczas allogenicznego przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych (EBVALLO)

Kontekst naukowy

Wirus Epsteina-Barra odgrywa przyczynową rolę w patogenezie wielu różnych chłoniaków. Potransplantacyjne choroby limfoproliferacyjne (PTLD) są najczęstszymi proliferacjami indukowanymi przez EBV. Częstość występowania PTLD po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych jest mniejsza niż 5%, ale może wzrosnąć nawet o 10-20% u pacjentów z ustalonymi czynnikami ryzyka. EBV-DNAemia jest predyktorem EBV-PTLD i jest rutynowo wykonywana przy użyciu qPCR na pełnej krwi. Zapobiegawcze strategie terapeutyczne z użyciem przeciwciała anty-CD20 są stosowane, gdy pacjenci przekraczają określony próg EBV-DNAemia. To podejście pozostaje ograniczone, ponieważ nie rozróżnia limfoproliferacji indukowanej przez EBV (cykl utajony) i/lub wirusa replikującego (cykl replikacyjny).

Modyfikacje epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w regulowaniu przejścia od ekspresji genów utajonych do litycznych. Specyficzne modyfikacje DNA można uznać za sygnatury molekularne genomów EBV związane ze statusem infekcji wirusowej (utajone vs lityczne). W związku z tym sygnatury te można sobie wyobrazić jako potężne narzędzie do charakteryzowania stanu infekcji wirusowej in vivo.

Opis projektu Naszym głównym celem jest oszacowanie odpowiednich odsetków genomów litycznych i latentnych EBV (komórek proliferujących) u pacjentów z wysoką EBV-DNAemia po allogenicznym przeszczepie komórek macierzystych HSCT poprzez analizę epigenetycznych modyfikacji genomu EBV na konkretne witryny. Naszymi drugorzędnymi celami są i) określenie czynników ryzyka związanych z każdym profilem „utajonego i litycznego EBV” oraz ii) skorelowanie profili „utajonego i litycznego EBV” z odpowiedzią na infuzję rytuksymabu i wynikami pacjentów.

W tym celu zostanie przeprowadzone badanie retrospektywne (n=80) i prospektywne (szacunek n=58). Poszczególne etapy tego projektu to:

1. Badanie modyfikacji epigenetycznych. Laboratorium opracowuje nowe podejście do rozróżniania genomów utajonych i litycznych.
2. Zrealizowanie analizy ilościowej metodą RT-PCR różnych transkryptów EBV specyficznych dla fazy utajonej lub litycznej wirusa. Ta metoda zostanie zastosowana do RNA wyekstrahowanego z próbek krwi pacjentów z podwyższonym mianem wirusa EBV, w warunkach zachowania integralności RNA. Wyniki zostaną zweryfikowane na prospektywnej kohorcie pacjentów HSCT (n=58) (szpital Saint-Antoine i szpital La Pitié-Salpêtrière).
3. Przeprowadzenie analizy ilościowej genomów wirusa EBV w próbkach osocza, śliny i krwi ogólnej za pomocą aktualnych rutynowych procedur Oprócz próbek krwi ogólnej pobierane będzie osocze i ślina, ponieważ wiadomo, że wolne cząsteczki wirusa gromadzą się w tych płynach biologicznych po reaktywacji wirusa EBV. Próbki te będą traktowane zgodnie ze znormalizowanymi procedurami, które są rutynowo stosowane w laboratorium wirusologii medycznej do ilościowego oznaczania EBV w próbkach ludzkich.

Oczekiwane wyniki Poprzez ustanowienie prostej metody badania epigenetycznych modyfikacji genomów EBV, spodziewamy się zrozumieć znaczenie wysokiego miana wirusa EBV i patofizjologii PTLD po HSCT. Naszym celem jest rozróżnienie profili utajonych / litycznych pacjentów po HSCT i skorelowanie ich odpowiedniego ryzyka rozwoju PTLD. Ustalenie epigenetycznego profilu EBV w warunkach po HSCT w obliczu zwiększonego miana wirusa i PTLD poprawi nasze zrozumienie mechanizmów biologicznych określających status EBV po HSCT. Powinno to poprawić główne problemy medyczne i ekonomiczne. Wyniki te mogą mieć duże znaczenie terapeutyczne