Wyniki ludzkiego mikrobiomu i IVF

CEL STUDIÓW

Scharakteryzowanie mikrobiomu żeńskiego układu rozrodczego i przewodu pokarmowego oraz męskiego układu rozrodczego u pacjentek i partnerów poddawanych IVF oraz określenie, czy istnieją jakiekolwiek powiązania z przebiegiem ciąży.

Problem kliniczny

Mikrobiom układu rozrodczego i jego związek z wynikami reprodukcyjnymi jest tematem o coraz większym zainteresowaniu. Zmiany w mikrobiomie pochwy zostały powiązane z powikłaniami położniczymi, w tym poronieniami i porodami przedwczesnymi. Pojawiły się nowsze dane łączące mikrobiom pochwy z wynikami technologii wspomaganego rozrodu (ART). Prospektywne badanie obserwacyjne obejmujące 30 pacjentów, u których pobrano wymazy w różnych punktach czasowych podczas cyklu zapłodnienia in vitro-transferu zarodka (IVF-ET) w celu sekwencjonowania genu rybosomalnego RNA 16S, wykazało, że różnorodność gatunkowa mikrobiomu pochwy wyróżnia kobiety, które urodziło się żywe od tych, które tego nie zrobiły, a zwiększona różnorodność wiązała się z gorszymi wynikami; populacja pacjentów była jednak niejednorodna i niewielka.

Dostępne są ograniczone informacje dotyczące mikrobiomu górnych dróg rodnych i jego związku z wynikami reprodukcyjnymi, szczególnie w warunkach ART. Badania przeprowadzone wyłącznie w celu scharakteryzowania mikrobiomu górnych dróg rodnych opierały się na próbkach histerektomii w celu oceny kolonizacji, wykluczając w ten sposób ocenę jakiegokolwiek związku z wynikami reprodukcyjnymi. Być może pierwsze badanie mające na celu zbadanie związku między mikrobiomem górnych dróg rodnych a wynikami ART wykorzystywało technologię opartą na hodowli na końcówkach cewnika do transferu zarodków. Jednak w tym badaniu wykorzystano technologię opartą na kulturach, przy czym zgłoszono tylko cztery główne bakterie. Późniejsze badania uwydatniły ograniczenia technologii opartej na kulturach, a mianowicie to, że opiera się ona na udanej hodowli, co często prowadzi do niedoszacowania różnorodności organizmów.

Ponieważ technologia oparta na sekwencjonowaniu zyskała popularność, a ograniczenia technologii opartej na kulturach stały się bardziej widoczne, wzrosło zainteresowanie wykorzystaniem sekwencjonowania do scharakteryzowania mikrobiomu. W jednym z niedawnych badań wykorzystano technologię opartą na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) na końcówkach cewników do transferu zarodków w celu oceny specyficznego dla bakterii genu rybosomalnego 16S w celu scharakteryzowania mikrobiomu górnych dróg rodnych u pacjentów poddawanych transferowi zarodków. Chociaż służyło to jako dowód koncepcji dla tej metody charakteryzowania mikrobiomu, ograniczona wielkość próbki nie pozwalała na wyciągnięcie jakichkolwiek wniosków dotyczących jej związku z wynikami reprodukcyjnymi. W kolejnym badaniu z wykorzystaniem technologii opartej na sekwencjach zbadano próbki płynu endometrialnego i aspiratu z pochwy u 35 kobiet w cyklu poprzedzającym IVF i stwierdzono, że obecność mikroflory niezdominowanej przez Lactobacillus w endometrium była związana ze znacznym spadkiem implantacji, trwającej ciąży i żywe narodziny.

Chociaż istnieją pewne dane łączące zdrowie reprodukcyjne i mikrobiom żeńskiego układu rozrodczego, istnieje mniej informacji dotyczących jego związku z mikrobiomem męskiego układu rozrodczego. Jedno badanie przekrojowe badające kolonizację nasienia przez drobnoustroje wykazało związek z parametrami nasienia. Inne badanie, w którym zbadano posiewy z pochwy i nasienia u 951 par poddanych IVF, wykazało, że dodatnie posiewy bakteryjne zarówno z pochwy, jak i nasienia zmniejszyły częstość ciąż klinicznych i zwiększyły częstość poronień bardziej niż sama infekcja pochwy. Mikrobiom męskiego układu rozrodczego wymaga dalszych badań w tym kontekście.

Mikrobiom przewodu pokarmowego odgrywa ważną rolę w zdrowiu i chorobach człowieka, z wieloma udokumentowanymi powiązaniami ze stanami chorobowymi, takimi jak otyłość, cukrzyca i zaburzenia żołądkowo-jelitowe. Ostatnie dane sugerują, że zmiany w mikroflorze przewodu pokarmowego są związane z porodem przedwczesnym. Mikrobiom dróg moczowych został podobnie zbadany i powiązany z wieloma stanami chorobowymi, takimi jak nietrzymanie moczu i przewlekłe zapalenie gruczołu krokowego.

Do tej pory nie opublikowano badań oceniających związek mikrobiomu przewodu pokarmowego lub mikrobiomu moczu z wynikami ciąży po zapłodnieniu in vitro.

Uważa się, że ludzki mikrobiom moduluje układ odpornościowy i obecność ogólnoustrojowego stanu zapalnego. Rośnie zainteresowanie związkiem przewlekłego ogólnoustrojowego stanu zapalnego z zaburzeniami rozrodczymi. Zidentyfikowano szereg biomarkerów, które odzwierciedlają przewlekłe ogólnoustrojowe zapalenie. Interleukina-6 (IL-6) jest jednym z takich biomarkerów, który ma udokumentowane powiązania z PCOS, endometriozą i niepłodnością. Takie biomarkery nie były jeszcze badane w związku z wynikami ciąży po zapłodnieniu in vitro.

Celem tych badań jest przeprowadzenie prospektywnego badania obserwacyjnego na dużą skalę, mającego na celu scharakteryzowanie mikrobiomu żeńskiego układu rozrodczego (zarówno górnego, jak i dolnego) w różnych punktach czasowych u pacjentek poddawanych IVF. Ponadto planujemy zbadać mikrobiom żeńskiego przewodu pokarmowego, żeńską mikroflorę układu moczowego oraz mikrobiom męskiego układu rozrodczego, pobierając ukierunkowane próbki podczas cykli leczenia pacjentów. Na koniec ocenimy surowicę żeńską i męską pod kątem biomarkerów stanu zapalnego. Naszym celem jest zidentyfikowanie wszelkich związków z wynikami ciąży, które mogą służyć jako podstawa do późniejszego badania interwencyjnego.

PROJEKT BADAWCZY

A. Lokalizacja studiów:

Reproductive Medicine Associates z New Jersey

B. Badana populacja:

Wszyscy pacjenci rozpoczynający autologiczny cykl IVF w naszym ośrodku zostaną poddani przeglądowi pod kątem włączenia. Zarejestrowanych zostanie do 1000 pacjentów.

Główne kryteria włączenia: Poniżej przedstawiono główne kryteria włączenia:

1. Pacjenci rozpoczynający autologiczny cykl IVF
2. Wiek pacjenta 18-45 lat; wiek partnera 18-60 lat
3. Partner planuje dostarczyć próbkę świeżego nasienia w dniu pobrania komórki jajowej
4. Pacjenci planujący poddanie się preimplantacyjnemu skriningowi genetycznemu (PGS) zarodków z transferem pojedynczego zarodka (SET)

Główne kryteria wykluczenia: Poniżej przedstawiono kryteria wykluczenia:

1. > 1 poprzedni nieudany cykl IVF
2. Powielanie stron trzecich
3. Planuje bankowanie zarodków
4. Partner używający nasienia krio lub nasienia chirurgicznego w dniu pobrania
5. Stosowanie antybiotyków przez partnera płci męskiej lub żeńskiej w ciągu 1 miesiąca od rozpoczęcia cyklu IVF
6. Anomalie Mullera, z wyłączeniem macicy łukowatej
7. Mięśniaki podśluzówkowe
8. Historia operacji macicy, z wyłączeniem polipektomii, D&C i cięcia cesarskiego
9. Komunikujący się hydrosalpinx bez planów chirurgicznej korekty przed transferem zarodka

C. Procedury badawcze:

Eksperymentalny projekt

Proponowane badanie jest prospektywnym badaniem obserwacyjnym, które ma na celu scharakteryzowanie mikrobiomu żeńskiego układu rozrodczego w różnych punktach czasowych podczas cyklu IVF i określenie, czy istnieją jakiekolwiek różnice w mikrobiomie w odniesieniu do wyników ciąży. Ponadto zostaną pobrane próbki w celu oceny mikrobiomu żeńskiego przewodu pokarmowego, żeńskiej mikroflory układu moczowego, męskiego układu rozrodczego oraz biomarkerów ogólnoustrojowego stanu zapalnego.

Procedury i analizy kliniczne związane z badaniem

Wszyscy pacjenci rozpoczynający autologiczny cykl IVF w naszym ośrodku zostaną poddani przeglądowi pod kątem włączenia. Skontaktujemy się z pacjentami spełniającymi kryteria badania w celu ewentualnej rejestracji. Po zarejestrowaniu pacjenci i partnerzy otrzymają zgodę na udział w badaniu. Będą kontynuować leczenie zgodnie z rutynowym protokołem, a próbki zostaną pobrane do oceny mikrobiomu w wyznaczonych punktach czasowych.

Jedynymi procedurami związanymi z badaniem, które odbiegają od rutynowej opieki, będzie pobieranie próbek do wykorzystania w celu scharakteryzowania mikrobiomu i ogólnoustrojowego stanu zapalnego w kilku punktach czasowych podczas całej opieki:

• Płeć żeńska

  • Podczas świeżego cyklu IVF: Dodatkowa probówka krwi zostanie pobrana od partnerki w czasie rutynowego pobierania krwi w celu monitorowania cyklu.
  • Dzień pobrania oocytów: Próbka moczu ze środkowego strumienia zostanie dostarczona przez partnerkę rano w dniu pobrania oocytów. Wymazy z szyjki macicy, pochwy, policzka i odbytnicy zostaną pobrane od pacjentki w stanie sedacji tuż przed zabiegiem pobrania oocytów.
  • Podczas cyklu FET: Dodatkowa probówka krwi zostanie pobrana od partnerki podczas rutynowego pobierania krwi w celu monitorowania cyklu.
  • Skan w połowie proliferacji podczas pierwszego cyklu FET: Po minimum 8 dniach ekspozycji na estrogen, drugi zestaw wymazów z szyjki macicy i pochwy zostanie pobrany bezpośrednio przed planowanym USG pacjentki.
  • Dzień FET: Kiedy pacjentka zgłasza się do transferu zarodków, trzeci zestaw wymazów z szyjki macicy i pochwy zostanie pobrany bezpośrednio przed wykonaniem transferu zarodków. Ponadto najbardziej dystalna 5-milimetrowa część cewnika transferowego zostanie pobrana po przeniesieniu zarodka.

• Męski

  • Podczas świeżego cyklu IVF: Jedna probówka krwi zostanie pobrana od partnera płci męskiej.
  • Dzień pobrania oocytów: Przed jakimkolwiek przetwarzaniem zostanie pobrany wymaz ze świeżej próbki nasienia dostarczonej przez partnera.

Krew będzie mogła skrzepnąć przed wirowaniem. Próbki zostaną podzielone na porcje i przeniesione do -80°C w celu przechowywania. Następnie zostaną rozmrożone w razie potrzeby do analizy biomarkerów ogólnoustrojowego stanu zapalnego. Pozostałe porcje będą przechowywane do potencjalnych przyszłych badań.

Wszystkie inne próbki zostaną poddane lizie komórkowej, oczyszczeniu DNA i sekwencjonowaniu nowej generacji specyficznego dla bakterii genu rybosomu 16S zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.

Wyniki cyklu będą rejestrowane zgodnie z rutynową praktyką.

D. Informacje dotyczące ryzyka/bezpieczeństwa:

Główne zagrożenia związane z pobieraniem krwi to dyskomfort, krwawienie i siniaki. Zostaną podjęte wszelkie starania, aby skoordynować pobieranie krwi do badania z rutynowymi pobraniami krwi wykonywanymi w ramach opieki klinicznej nad pacjentem. Głównym ryzykiem związanym z pobieraniem wymazów z pochwy/szyjki macicy jest dyskomfort. Pobieranie wymazów z jamy ustnej i odbytu będzie wykonywane w znieczuleniu podczas pobierania oocytów i dlatego nie wiąże się z takim ryzykiem. Pobranie próbki moczu ze środkowego strumienia zostanie wykonane, gdy pacjentka opróżni pęcherz przed pobraniem oocytów i nie stwarza żadnego dodatkowego ryzyka. Pobranie nasienia nie wiąże się z żadnym dodatkowym ryzykiem, ponieważ partner dostarcza próbkę w ramach planu leczenia, a wymaz pobierany jest po oddaniu próbki. Pobranie końcówki cewnika transferowego nie wiąże się z żadnym dodatkowym ryzykiem, ponieważ odbywa się po zakończeniu transferu zarodka i nie dotyczy bezpośrednio pacjentki.

E. Zarządzanie danymi:

Statystyczna ocena wyników

Mikrobiom w różnych punktach czasowych zostanie porównany dla pacjentek z trwającą ciążą (zdefiniowaną na podstawie obecności bicia serca płodu w momencie wypisu) i tych bez. Aby scharakteryzować różnorodność próbek, zostaną wykorzystane dwie metryki różnorodności alfa: wskaźnik różnorodności Shannona (SDI) i chao1.

Harmonogram długości badania — 25 miesięcy

1. Czas rekrutacji badanej populacji – 12 miesięcy
2. Harmonogram dla każdej osoby biorącej udział w badaniu, od rejestracji do porodu (w przypadku ciąży) - 10 miesięcy
3. Analiza statystyczna i przygotowanie manuskryptu - 3 miesiące