Amphiregulin Versus Non-Amphiregulin Suplementacja do pożywki hodowlanej dojrzewania w IVM.

W badaniu tym można wyróżnić dwa rodzaje pacjentów:

• Morfologia policystycznych jajników + normalna długość cyklu (do 35 dni). Większość pacjentek z tej grupy ma niezespołowe policystyczne jajniki i nie ma PCOS. U tych pacjentów AMH jest tylko umiarkowanie podwyższone, a pod wpływem FSH następuje cykliczny rozwój pęcherzyków.
• PCOS - morfologia policystycznych jajników + skąpe miesiączki (miesiączki występujące w odstępach dłuższych niż 35 dni, z zaledwie czterema do dziewięcioma miesiączkami w ciągu roku) lub brak miesiączki. U tych pacjentów, z często silnie podwyższonym poziomem AMH i towarzyszącą hiperandrogenemią, względna oporność na FSH powoduje zatrzymanie wzrostu pęcherzyków w stanie małych pęcherzyków antralnych. Spontaniczna selekcja dominującego pęcherzyka nie występuje lub występuje rzadko. Duża część pęcherzyków jest atretyczna. Znaczna część tych pacjentów ma BMI powyżej 25. Pacjenci ci na ogół otrzymują ten sam standardowy schemat stymulacji gonadotropinami, co pacjenci z poprzedniej grupy, ale jeśli największe pęcherzyki mają średnicę mniejszą niż 8 mm w trzecim dniu stymulacji, pacjenci otrzymują jeden lub dwa dodatkowe dni stymulacji gonadotropinami. Co więcej, ci pacjenci na ogół przyjmują OCP na dwa-trzy tygodnie przed rozpoczęciem cyklu IVM i rozpoczynają stymulację w przybliżeniu piątego dnia po odstawieniu OCP. Jednakże, ponieważ ci pacjenci nie mają endogennej rekrutacji pęcherzyków kierowanej przez FSH, rozpoczęcie stymulacji jest raczej elastyczne.
• Stosowanie OCP (doustnej pigułki antykoncepcyjnej) przed cyklem IVM jest obowiązkowe. OCP (na przykład Microgynon 30 mikrogramów) będzie podawany codziennie w celu oczyszczenia pęcherzyków atretycznych w jajniku. OCP będzie podawany od 14 do 21 dni (ta metoda pozwala lepiej zaprogramować cykle i obciążenie pracowni embriologicznej).

Przed pierwszym cyklem IVM (wizyta przesiewowa): Wszyscy pacjenci zostaną poddani badaniu ultrasonograficznemu miednicy w celu oceny, czy kwalifikują się do leczenia IVM. Pacjenci zostaną poddani badaniu serologicznemu krwi (zapalenie wątroby typu B, HIV, kiła) oraz podstawowemu profilowaniu hormonalnemu (LH, FSH, E2, progesteron, AMH, SHBG, testosteron). Dodatkowa analiza TSH, przeciwciał przeciwko tyroperoksydazie, prolaktyny. Należy zgłosić wszelkie leki towarzyszące przyjmowane w ciągu ostatnich 3 miesięcy przed próbą IVM.

Pierwszy cykl leczenia IVM:

• Pierwsza wizyta w klinice:

  • Wszyscy uczestnicy skontaktują się z pielęgniarką uczestniczącą w badaniu w dniu cyklu (cd1), aby zainicjować pierwszy cykl hodowli pojemnościowej. Jeśli cd1 przypada na weekend, badani skontaktują się z pielęgniarką badającą w poniedziałek. Pacjentka zgłasza się do kliniki w 1, 2 lub 3 dniu krwawienia miesiączkowego. Wykonuje się badanie USG w celu wykluczenia torbieli jajnika oraz pobiera krew do oceny hormonalnej (HCG, FSH, LH, E2, progesteron). Wieczorem trzeciego dnia cyklu podczas pierwszej wizyty w klinice zostanie rozpoczęta elastyczna stymulacja gonadotropinami w celu przyspieszenia rozwoju pęcherzyków. Pierwsza dawka HP-hMG 150 IU o godzinie 14:00. Druga dawka następnego dnia HP-hMG 150 IU o godzinie 14:00. Pacjentka wróci na USG miednicy i badanie krwi (FSH, LH, E2, progesteron) po dwóch dniach stymulacji HP-hMG 150 IU (tj. rano dnia 6).
  • Do pacjentek z krwawieniem OCP: W pierwszym, drugim, trzecim lub czwartym dniu krwawienia z odstawienia, które występuje po odstawieniu OCP, pacjentka zgłosi się do kliniki w celu wykonania USG miednicy oraz pobrania próbki krwi do oceny hormonalnej (FSH , LH, E2, progesteron, AMH, całkowity testosteron w surowicy, SHBG). W dniu pierwszej wizyty w klinice zostanie uruchomiona elastyczna stymulacja HP-hMG w celu przyspieszenia rozwoju pęcherzyków, pierwszą dzienną dawką HP-hMG o godzinie 20:00. Po dwóch dniach stymulacji HP hMG pacjentka wróci na USG miednicy oraz badanie krwi (FSH, LH, E2, progesteron).

• Druga wizyta w poradni w dniu 6 (po 2 dniach leczenia HP-hMG):

  • Jeśli w USG wykaże się obecność jednego dominującego pęcherzyka o średnicy większej niż 12 mm, a pozostałe pęcherzyki mniejsze niż 10 mm, pobranie oocytu (OR) zostanie zaplanowane dwa dni później, między 8:00 a 9:00. Ważne jest, aby zachować OR 42 - 46 godzin po ostatnim wstrzyknięciu HP-hMG jako stały czas. Jeśli w badaniu USG wykaże się, że maksymalna średnica pęcherzyka jest mniejsza niż 8 mm, o godzinie 14:00 zostanie podany końcowy zastrzyk HP-hMG. a pobranie oocytów (OR) zaplanowano dwa dni później, między 8:00 a 9:00. Ważne jest, aby zachować OR 42 - 46 godzin po ostatnim wstrzyknięciu HP-hMG jako stały czas.
  • Dla pacjentów z krwawieniem OCP: Jeśli w badaniu USG wykaże się, że maksymalna średnica pęcherzyka wynosi ok. 9 mm, ostatnia iniekcja HP-hMG zostanie podana o godzinie 14:00. a pobranie oocytów (OR) zaplanowano dwa dni później, między 8:00 a 9:00 (w znieczuleniu ogólnym - dokładny czas OR należy omówić z pielęgniarkami operującymi i anestezjologiem). Ważne jest, aby czas OR był stały i wynosił 42-46 godzin od ostatniego wstrzyknięcia HP-hMG.

• Trzecia wizyta - Pobranie oocytów: Pobranie oocytów (OR) zaplanowano między 8:00 a 10:00 (w znieczuleniu ogólnym). W dniu LUB:

  • Rejestruje się badanie ultrasonograficzne obu jajników i wyściółki endometrium.
  • Zostanie pobrana próbka krwi do profilowania hormonalnego (LH, FSH, E2, progesteron).
• Wszystkie kompleksy cumulus-oocyt (COC) pobrane od pacjenta hoduje się w pożywce CAPA przez 24 godziny.

• Po hodowli CAPA połowa oocytów zostanie losowo podzielona (50/50) na dwie pożywki wyzwalające dojrzewanie.

  • Grupa 1: media Medicult IVM + AREG+FSH+HSA+insulina+estradiol (grupa AREG-TRIGGER)
  • Grupa 2: Medicult IVM media + FSH+GH+hCG+HSA (grupa CONTROL-TRIGGER) bez dodanego AREG

• Dojrzewanie oocytów in vitro:

  • Oceń i zarejestruj COC pod kątem masy wzgórka (CM) i kontaktu wzgórka między oocytem a komórkami wzgórka. Za każdym razem rób zdjęcia. Odrzucić w pełni obnażone, zdegenerowane oocyty.
  • Za pomocą mikropipety Eppendorf przenieś połowę COC (po 5-10 jednorazowo) z szalki do hodowli Capacitation do „mycia szalki” zawierającej „Maturation Medium 1 (AREG-TRIGGER medium)” i dokładnie je umyj (załaduj końcówki pipety 5µl, maks. 10 ul). Następnie przenieś COC do „szalki IVM” z „Maturation Medium 1 (AREG-TRIGGER medium)”.
  • Przenieś drugą połowę COC z szalki do hodowli kapacytacyjnej do „myjącej szalki” zawierającej „Maturation Medium 2 (pożywka CONTROL-TRIGGER)” i dokładnie je umyj (załaduj końcówki pipety 5 µl, maks. 10 ul). Następnie przenieś COC do „szalki IVM” z „Maturation Medium 2 (CONTROL-TRIGGER medium)”.
  • Przechowuj COC w pulach po ~10 sztuk.
  • Odpowiednio oznakować płytkę i hodować COC przez 30-32 godziny w inkubatorze.
• Ocena dojrzewania (MII, GVBD, GV) zostanie przeprowadzona po 30 godzinach. Oocyty, które przeszły GVBD, ale bez wyraźnego PB, zostaną ocenione po 32 godzinach. Inseminacja zostanie przeprowadzona za pomocą docytoplazmatycznej iniekcji plemnika (3-4 godziny po pobraniu komórki jajowej lub sprawdzeniu jej dojrzałości); zapłodnione zostaną tylko dojrzałe oocyty.
• Kontrola zapłodnienia zostanie przeprowadzona pod odwróconym mikroskopem po 16-18 godzinach od inseminacji. Ocena zarodków zostanie przeprowadzona w 68 ± 1 godzinie po zapłodnieniu przy użyciu konsensusu stambulskiego. Zastosowano standardowy protokół witryfikacji zarodka. Zarodki będą witryfikowane zgodnie z otrzymanym protokołem stymulacji (grupa 1 AREG-TRIGGER lub grupa 2 - CONTROL-TRIGGER).
• Transfer zamrożonych zarodków: pacjentka zostanie losowo przydzielona do losowego otrzymania zarodka z AREG-TRIGGER lub CONTROL-TRIGGER. W przypadku braku dostępnych zarodków z randomizowanej grupy, przenoszono zarodki z drugiej grupy.
• Pierwszy test ciążowy wykonano 14 dni po transferze zarodka; pozytywny test ciążowy zdefiniowano jako beta hCG w surowicy >5 mIU/ml
• Ciążę kliniczną zdefiniowano jako co najmniej jeden pęcherzyk ciążowy w badaniu ultrasonograficznym w 7 tygodniu ciąży z wykryciem czynności serca.
• Trwająca ciąża została zdefiniowana jako ciąża z wykrywalną częstością akcji serca w ≥12 tygodniu ciąży po zakończeniu pierwszego transferu.
• Urodzenie żywe zdefiniowano jako narodziny co najmniej jednego noworodka po 24 tygodniach ciąży wykazującego jakiekolwiek oznaki życia (bliźniaki były liczone pojedynczo).
• Po pierwszym nieudanym cyklu IVM: Dane kliniczne i embriologiczne oraz wyniki związane z pierwszym cyklem IVM (skumulowane cykle świeżych i mrożonych zarodków) zostaną omówione w celu ustalenia bardziej dostosowanego do pacjenta podejścia do ewentualnego drugiego cyklu IVM. Dostosowane do pacjenta podejście w drugim cyklu IVM może polegać na modyfikacji postępowania w fazie folikularnej.