Suplementação de anfirregulina versus não-anfirregulina para meio de cultura de maturação em IVM.

Existem dois tipos de pacientes que podem ser distinguidos neste estudo:

• Morfologia ovariana policística + duração normal do ciclo (até 35 dias). A maioria dos indivíduos neste grupo tem ovários policísticos não sindrômicos e não tem SOP. Nesses pacientes, o AMH está apenas moderadamente elevado e o desenvolvimento folicular cíclico ocorre sob a influência do FSH.
• SOP - Morfologia ovariana policística + oligomenorréia (períodos menstruais ocorrendo em intervalos superiores a 35 dias, com apenas quatro a nove períodos em um ano) ou amenorréia. Nesses pacientes, frequentemente com níveis fortemente elevados de AMH e hiperandrogenemia concomitante, a resistência relativa ao FSH resulta na interrupção do crescimento folicular no estado folicular antral pequeno. A seleção espontânea de um folículo dominante não ocorre ou ocorre raramente. Uma grande proporção de folículos é atrésica. Uma proporção importante desses pacientes tem um IMC maior que 25. Esses pacientes geralmente recebem o mesmo regime padrão de estimulação com gonadotrofina que os pacientes do grupo anterior, mas se os folículos maiores tiverem diâmetro inferior a 8 mm no terceiro dia de estimulação, os pacientes recebem um ou dois dias suplementares de estimulação com gonadotrofina. Além disso, esses pacientes geralmente tomam duas a três semanas de ACO antes do início do ciclo IVM e iniciam a estimulação aproximadamente no dia cinco após a retirada do ACO. No entanto, como esses pacientes não apresentam recrutamento endógeno de folículos por FSH, o início da estimulação é bastante flexível.
• O uso de ACO (pílula anticoncepcional) antes do ciclo MIV é obrigatório. OCP (por exemplo Microgynon 30 microgramas) será administrado diariamente, para limpar os folículos atrésicos no ovário. OCP será dado entre 14 e 21 dias (este método permite uma melhor programação dos ciclos e da carga horária no laboratório de embriologia).

Antes do primeiro ciclo de IVM (visita de triagem): Todos os indivíduos serão submetidos a uma ultrassonografia pélvica para avaliar a adequação ao tratamento com IVM. Os pacientes serão submetidos a um exame de sangue para sorologia (Hepatite B, HIV, sífilis) e perfil hormonal basal (LH, FSH, E2, progesterona, AMH, SHBG, Testosterona). Análise adicional de TSH, anticorpos tiroperoxidase, prolactina. Qualquer medicação concomitante tomada nos últimos 3 meses antes da tentativa de IVM deve ser notificada.

Primeiro ciclo de tratamento IVM:

• Primeira consulta clínica:

  • Todos os sujeitos entrarão em contato com a enfermeira do estudo no dia do ciclo (cd1) para iniciar o primeiro ciclo de cultura de Capacitação. Se cd1 for durante o fim de semana, os sujeitos entrarão em contato com a enfermeira do estudo na segunda-feira. O sujeito comparecerá à clínica no dia 1, 2 ou 3 do sangramento menstrual. Uma ultrassonografia é realizada para descartar a existência de cistos ovarianos e uma amostra de sangue é coletada para avaliação hormonal (HCG, FSH, LH, E2, progesterona). Na noite do dia 3 do ciclo da primeira visita clínica, a estimulação flexível de Gonadotrofina será iniciada para melhorar o desenvolvimento folicular. A primeira dose de HP-hMG 150 UI às 14h. Segunda dose no dia seguinte de HP-hMG 150 UI às 14h. O sujeito retornará para uma ultrassonografia pélvica e um exame de sangue (FSH, LH, E2, progesterona) após os dois dias de estimulação HP-hMG 150 UI (ou seja, na manhã do dia 6).
  • Para pacientes com sangramento de OCP: No primeiro, segundo, terceiro ou quarto dia do sangramento de privação que ocorre após a interrupção do OCP, o indivíduo comparecerá à clínica para fazer uma ultrassonografia pélvica e uma amostra de sangue será coletada para avaliação hormonal (FSH , LH, E2, progesterona, AMH, testosterona sérica total, SHBG). No dia da primeira visita clínica, a estimulação flexível de HP-hMG será iniciada para melhorar o desenvolvimento folicular, em uma primeira dose diária de HP-hMG às 20h. O sujeito retornará para uma ultrassonografia pélvica e um exame de sangue (FSH, LH, E2, progesterona) após dois dias de estimulação HP hMG.

• Segunda visita clínica no dia 6 (após 2 dias de tratamento com HP-hMG):

  • Se a ultrassonografia mostrar a presença de um único folículo dominante maior que 12 mm com os demais folículos todos menores que 10 mm, a coleta de ovócitos (SO) será agendada dois dias depois, entre 8h e 9h. É importante manter o OR 42 - 46 horas após a última injeção de HP-hMG como um tempo fixo. Se a ultrassonografia mostrar um diâmetro folicular máximo inferior a 8 mm, uma injeção final de HP-hMG será administrada às 14h. e a coleta de ovócitos (SO) será agendada dois dias depois, entre 8:00 e 9:00 h. É importante manter o OR 42 - 46 horas após a última injeção de HP-hMG como um tempo fixo.
  • Para pacientes com sangramento OCP: Se a ultrassonografia mostrar um diâmetro folicular máximo de aprox. 9 mm, uma injeção final de HP-hMG será administrada às 14h. e a coleta de oócitos (SO) será agendada dois dias depois, entre 8:00 e 9:00 h (sob anestesia geral - o horário exato da SO deve ser discutido com enfermeiras operacionais e anestesista). É importante manter o tempo de OR constante em 42 -46 horas após a última injeção de HP-hMG.

• Terceira consulta - Recuperação de ovócitos: A captação de ovócitos (SO) será agendada entre 8:00 e 10:00 h (sob anestesia geral). No dia da sala de cirurgia:

  • Uma ultrassonografia de ambos os ovários e do revestimento endometrial é registrada.
  • Uma amostra de sangue será obtida para perfilação hormonal (LH, FSH, E2, progesterona).
• Todos os complexos cumulus-oócitos (COC) retirados do paciente são cultivados em meio CAPA por 24 horas.

• Após o cultivo CAPA, metade dos oócitos será dividida aleatoriamente (50/50) para os dois meios de maturação.

  • Grupo 1: Meio Medicult IVM + AREG+FSH+HSA+Insulina+Estradiol (grupo AREG-TRIGGER)
  • Grupo 2: Meio Medicult IVM + FSH+GH+hCG+HSA (grupo CONTROL-TRIGGER) sem adição de AREG

• Maturação oocitária in vitro:

  • Avalie e registre COCs para massa cumulus (CM) e contato cumulus entre oócito e células cumulus. Cada vez tire fotos. Descarte os oócitos totalmente desnudos e degenerados.
  • Transfira metade dos COCs (5-10 de cada vez) do prato de cultura Capacitation para o "prato de lavagem" contendo "Maturation Medium 1 (meio AREG-TRIGGER)" usando uma micropipeta Eppendorf e lave-os bem (carregue as pontas das pipetas com 5µl, máx. 10µl). Em seguida, transfira os COCs para a "placa IVM" com "meio de maturação 1 (meio AREG-TRIGGER)".
  • Transfira a segunda metade dos COCs do prato de cultura de Capacitação para o "prato de lavagem" contendo "Meio de maturação 2 (meio CONTROL-TRIGGER)" e lave-os bem (carregue as pontas das pipetas com 5µl, máx. 10µl). Em seguida, transfira COCs para o "prato IVM" com "meio de maturação 2 (meio CONTROL-TRIGGER)".
  • Mantenha COCs em grupos de ~10.
  • Rotule a placa adequadamente e cultive os COCs por 30 a 32 horas em uma incubadora.
• A avaliação da maturação (MII, GVBD, GV) será feita às 30 horas. Oócitos que sofreram GVBD, mas sem PB claro, serão avaliados em 32 horas. A inseminação será realizada por meio de injeção intracitoplasmática de espermatozoides (3-4 horas após a coleta do oócito ou verificação da maturação); apenas ovócitos maduros serão inseminados.
• A verificação da fertilização será realizada sob um microscópio invertido 16-18 horas após a inseminação. A avaliação do embrião será realizada 68 ±1 horas após a fertilização usando o consenso de Istambul. Protocolo padrão de vitrificação de embriões usado. Os embriões serão vitrificados conforme protocolo de estimulação obtido (grupo 1 AREG-TRIGGER ou grupo 2 - CONTROL-TRIGGER).
• Transferência de embriões congelados: A paciente será randomizada para receber embriões aleatoriamente de AREG-TRIGGER ou CONTROL-TRIGGER. Quando nenhum embrião do grupo randomizado estava disponível, o(s) embrião(es) do outro grupo foram transferidos.
• O primeiro teste de gravidez foi realizado 14 dias após a transferência do embrião; um teste de gravidez positivo foi definido como beta hCG sérico > 5 mIU/mL
• Gravidez clínica foi definida como pelo menos um saco gestacional na ultrassonografia na 7ª semana de gestação com a detecção da atividade do batimento cardíaco.
• Gravidez em andamento foi definida como gravidez com frequência cardíaca detectável em ≥12 semanas de gestação após a conclusão da primeira transferência.
• Nascido vivo foi definido como o nascimento de pelo menos um recém-nascido após 24 semanas de gestação exibindo qualquer sinal de vida (gêmeos eram uma única contagem).
• Após um primeiro ciclo IVM sem sucesso: Os dados e resultados clínicos e embriológicos relacionados ao primeiro ciclo IVM (ciclos cumulativos de embriões frescos e congelados) serão discutidos, para estabelecer uma abordagem mais personalizada para um eventual segundo ciclo IVM. A abordagem personalizada para o paciente no segundo ciclo IVM pode consistir na modificação do gerenciamento da fase folicular.