Amphiregulin Versus Supplemento non anphiregulin al terreno di coltura di maturazione in IVM.

In questo studio si possono distinguere due tipi di pazienti:

• Morfologia dell'ovaio policistico + durata normale del ciclo (fino a 35 giorni). La maggior parte dei soggetti in questo gruppo ha ovaie policistiche non sindromiche e non ha PCOS. In questi pazienti, l'AMH è solo moderatamente elevato e lo sviluppo follicolare ciclico avviene sotto l'influenza dell'FSH.
• PCOS - Morfologia dell'ovaio policistico + oligomenorrea (periodi mestruali che si verificano a intervalli superiori a 35 giorni, con solo da quattro a nove periodi in un anno) o amenorrea. In questi pazienti, con livelli di AMH spesso fortemente elevati e concomitante iperandrogenemia, la resistenza relativa all'FSH provoca l'arresto della crescita follicolare al piccolo stato follicolare antrale. La selezione spontanea di un follicolo dominante non si verifica o si verifica raramente. Una grande percentuale di follicoli è atretica. Una percentuale importante di questi pazienti ha un BMI superiore a 25. Questi pazienti generalmente ricevono lo stesso regime standard di stimolazione delle gonadotropine dei pazienti del gruppo precedente, ma se i follicoli più grandi hanno un diametro inferiore a 8 mm al terzo giorno di stimolazione, i pazienti ricevono uno o due giorni supplementari di stimolazione delle gonadotropine. Inoltre, questi pazienti generalmente assumono due-tre settimane di OCP prima dell'inizio del ciclo IVM e iniziano la stimolazione approssimativamente il quinto giorno dopo la sospensione dell'OCP. Tuttavia, poiché questi pazienti non hanno un reclutamento di follicoli guidato dall'FSH endogeno, l'inizio della stimolazione è piuttosto flessibile.
• L'uso di OCP (pillola contraccettiva orale) prima del ciclo IVM è obbligatorio. L'OCP (ad esempio Microgynon 30 microgrammi) verrà somministrato giornalmente, per eliminare i follicoli atresici nell'ovaio. L'OCP verrà somministrato per un periodo compreso tra 14 e 21 giorni (questo metodo consente una migliore programmazione dei cicli e del carico di lavoro nel laboratorio di embriologia).

Prima del primo ciclo IVM (Visita di screening): Tutti i soggetti saranno sottoposti a ecografia pelvica per valutare l'idoneità a sottoporsi al trattamento IVM. I pazienti verranno sottoposti a un esame del sangue per la sierologia (epatite B, HIV, sifilide) e il profilo ormonale di base (LH, FSH, E2, progesterone, AMH, SHBG, testosterone). Analisi aggiuntiva di TSH, anticorpi anti-tireoperossidasi, prolattina. Qualsiasi farmaco concomitante assunto negli ultimi 3 mesi prima del tentativo di IVM deve essere notificato.

Primo ciclo di trattamento IVM:

• Prima visita clinica:

  • Tutti i soggetti contatteranno l'infermiere dello studio il giorno del ciclo (cd1) per avviare il primo Ciclo di coltura di capacità. Se cd1 è durante il fine settimana, i soggetti contatteranno l'infermiere dello studio lunedì. Il soggetto parteciperà alla clinica il giorno 1, 2 o 3 del sanguinamento mestruale. Viene eseguita un'ecografia per escludere l'esistenza di cisti ovariche e viene prelevato un campione di sangue per la valutazione ormonale (HCG, FSH, LH, E2, progesterone). La sera del terzo giorno del ciclo della prima visita clinica, verrà avviata la stimolazione flessibile delle gonadotropine per migliorare lo sviluppo follicolare. La prima dose di HP-hMG 150 UI alle 14:00. Seconda dose il giorno successivo di HP-hMG 150 UI alle 14:00. Il soggetto tornerà per un'ecografia pelvica e un esame del sangue (FSH, LH, E2, progesterone) dopo i due giorni di stimolazione HP-hMG 150 UI (cioè la mattina del giorno 6).
  • Ai pazienti con sanguinamento da OCP: il giorno uno, due, tre o quattro dell'emorragia da sospensione che si verifica dopo l'interruzione dell'OCP, il soggetto si recherà in clinica per sottoporsi a un'ecografia pelvica e verrà prelevato un campione di sangue per la valutazione ormonale (FSH , LH, E2, progesterone, AMH, testosterone sierico totale, SHBG). Il giorno della prima visita clinica, verrà avviata la stimolazione flessibile HP-hMG per migliorare lo sviluppo follicolare, con una prima dose giornaliera di HP-hMG alle 20:00. Il soggetto tornerà per un'ecografia pelvica e un esame del sangue (FSH, LH, E2, progesterone) dopo due giorni di stimolazione HP hMG.

• Seconda visita clinica al giorno 6 (dopo 2 giorni di trattamento HP-hMG):

  • Se l'ecografia mostra la presenza di un singolo follicolo dominante più grande di 12 mm con gli altri follicoli tutti inferiori a 10 mm, il prelievo degli ovociti (OR) sarà programmato due giorni dopo, tra le 8:00 e le 9:00. È importante mantenere la sala operatoria 42 - 46 ore dopo l'ultima iniezione di HP-hMG come tempo fisso. Se l'ecografia mostra un diametro follicolare massimo inferiore a 8 mm, verrà somministrata un'iniezione finale di HP-hMG alle 14:00. e il prelievo degli ovociti (OR) sarà programmato due giorni dopo, tra le 8:00 e le 9:00 h. È importante mantenere la sala operatoria 42 - 46 ore dopo l'ultima iniezione di HP-hMG come tempo fisso.
  • Ai pazienti con sanguinamento da OCP: se l'ecografia mostra un diametro follicolare massimo di ca. 9 mm, verrà somministrata un'iniezione finale di HP-hMG alle 14:00. e il prelievo degli ovociti (OR) sarà programmato due giorni dopo, tra le 8:00 e le 9:00 (in anestesia generale - l'ora esatta dell'OR dovrebbe essere discussa con gli infermieri operativi e l'anestesista). È importante mantenere il tempo di OR costante a 42-46 ore dopo l'ultima iniezione di HP-hMG.

• Terza visita - Prelievo degli ovociti: il prelievo degli ovociti (OR) sarà programmato tra le 8:00 e le 10:00 (in anestesia generale). Il giorno dell'OR:

  • Viene registrata un'ecografia di entrambe le ovaie e del rivestimento endometriale.
  • Verrà prelevato un campione di sangue per il profilo ormonale (LH, FSH, E2, progesterone).
• Tutti i complessi cumulo-ovociti (COC) recuperati dal paziente vengono coltivati ​​in terreno CAPA per 24 ore.

• Dopo la coltura CAPA, la metà degli ovociti sarà divisa in modo casuale (50/50) nei due terreni di attivazione della maturazione.

  • Gruppo 1: Medicult IVM media + AREG+FSH+HSA+Insulina+Estradiolo (gruppo AREG-TRIGGER)
  • Gruppo 2: terreno Medicult IVM + FSH+GH+hCG+HSA (gruppo CONTROL-TRIGGER) senza aggiunta di AREG

• Maturazione degli ovociti in vitro:

  • Valutare e registrare i COC per la massa del cumulo (CM) e il contatto del cumulo tra le cellule dell'ovocita e del cumulo. Ogni volta scatta fotografie. Scartare gli ovociti completamente denudati e degenerati.
  • Trasferire metà dei COC (5-10 alla volta) dal piatto di coltura di capacitazione al "piatto di lavaggio" contenente "Mezzo di maturazione 1 (mezzo AREG-TRIGGER)" utilizzando una micropipetta Eppendorf e lavarli accuratamente (caricare i puntali delle pipette con 5µl, max. 10µl). Quindi trasferire i COC nel "piatto IVM" con "Maturation Medium 1 (AREG-TRIGGER medium)".
  • Trasferire la seconda metà dei COC dal piatto di coltura di capacitazione al "piatto di lavaggio" contenente "Mezzo di maturazione 2 (mezzo CONTROL-TRIGGER)" e lavarli accuratamente (caricare i puntali delle pipette con 5 µl, max. 10µl). Quindi trasferire i COC nel "piatto IVM" con "Maturation Medium 2 (mezzo CONTROL-TRIGGER)".
  • Mantenere i COC in pool di ~10.
  • Etichettare il piatto in modo appropriato e cultura COC 30-32 ore in un'incubatrice.
• La valutazione della maturazione (MII, GVBD, GV) sarà effettuata a 30 ore. Gli ovociti che hanno subito GVBD ma senza PB chiaro saranno valutati a 32 ore. L'inseminazione verrà eseguita mediante iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (3-4 ore dopo il prelievo degli ovociti o il controllo della maturazione); verranno inseminati solo gli ovociti maturi.
• Il controllo della fecondazione sarà eseguito al microscopio invertito a 16-18 ore dall'inseminazione. La valutazione dell'embrione verrà eseguita a 68 ± 1 ora dopo la fecondazione utilizzando il consenso di Istanbul. Protocollo standard di vitrificazione degli embrioni utilizzato. Gli embrioni saranno vetrificati in base al protocollo di stimolazione ottenuto (gruppo 1 AREG-TRIGGER o gruppo 2 - CONTROL-TRIGGER).
• Trasferimento di embrioni congelati: il paziente verrà randomizzato per ricevere embrioni in modo casuale da AREG-TRIGGER o CONTROL-TRIGGER. Se non erano disponibili embrioni del gruppo randomizzato, sono stati trasferiti embrioni dell'altro gruppo.
• Il primo test di gravidanza è stato eseguito 14 giorni dopo il trasferimento dell'embrione; un test di gravidanza positivo è stato definito come beta hCG sierica >5 mIU/mL
• La gravidanza clinica è stata definita come almeno un sacco gestazionale all'ecografia a 7 settimane di gestazione con il rilevamento dell'attività del battito cardiaco.
• La gravidanza in corso è stata definita come gravidanza con una frequenza cardiaca rilevabile a ≥12 settimane di gestazione dopo il completamento del primo trasferimento.
• La nascita dal vivo è stata definita come la nascita di almeno un neonato dopo 24 settimane di gestazione che mostra segni di vita (i gemelli erano un unico conteggio).
• Dopo un primo ciclo IVM non riuscito: Verranno discussi i dati clinici ed embriologici e i risultati relativi al primo ciclo IVM (cicli cumulativi di embrioni freschi e congelati), per stabilire un approccio più personalizzato per il paziente per un eventuale secondo ciclo IVM. L'approccio su misura del paziente nel secondo ciclo IVM potrebbe consistere nella modifica della gestione della fase follicolare.