Амфирегулин в сравнении с добавками, не содержащими амфирегулина, в культуральную среду для созревания в IVM.

В этом исследовании можно выделить два типа пациентов:

• Морфология поликистозных яичников + нормальная длина цикла (до 35 дней). Большинство субъектов в этой группе имеют несиндромальный поликистоз яичников и не имеют СПКЯ. У этих пациентов уровень АМГ повышен лишь умеренно, а циклическое развитие фолликулов происходит под влиянием ФСГ.
• СПКЯ - морфология поликистозных яичников + олигоменорея (менструальные периоды происходят с интервалом более 35 дней, всего от четырех до девяти менструаций в год) или аменорея. У этих пациентов, часто с сильно повышенным уровнем АМГ и сопутствующей гиперандрогенемией, относительная резистентность к ФСГ приводит к остановке роста фолликулов в состоянии малых антральных фолликулов. Самопроизвольного выбора доминантного фолликула не происходит или происходит редко. Большая часть фолликулов атретична. Значительная часть этих пациентов имеет ИМТ выше 25. Эти пациенты обычно получают тот же стандартный режим стимуляции гонадотропином, что и пациенты предыдущей группы, но если самые крупные фолликулы имеют диаметр менее 8 мм на третий день стимуляции, пациенты получают один или два дополнительных дня стимуляции гонадотропином. Более того, эти пациенты обычно принимают КОК за две-три недели до начала цикла ИВМ и начинают стимуляцию примерно на пятый день после отмены КОК. Однако, поскольку у этих пациенток нет рекрутинга фолликулов, вызванного эндогенным ФСГ, начало стимуляции достаточно гибкое.
• Использование КОК (оральные противозачаточные таблетки) перед циклом ИВМ является обязательным. OCP (например, Microgynon 30 мкг) будет вводиться ежедневно для очистки атретических фолликулов в яичниках. OCP назначают на срок от 14 до 21 дня (этот метод позволяет лучше программировать циклы и рабочую нагрузку в эмбриологической лаборатории).

Перед первым циклом IVM (скрининговый визит): все субъекты пройдут ультразвуковое сканирование органов малого таза, чтобы оценить пригодность для прохождения лечения IVM. Пациенты будут проходить анализ крови на серологию (гепатит В, ВИЧ, сифилис) и базовый гормональный профиль (ЛГ, ФСГ, Е2, прогестерон, АМГ, ГСПГ, тестостерон). Дополнительный анализ ТТГ, антител к тиреопероксидазе, пролактина. Следует уведомить о любых сопутствующих лекарствах, принимаемых за последние 3 месяца до попытки IVM.

Первый цикл лечения IVM:

• Первый визит в клинику:

  • Все субъекты свяжутся с медсестрой-исследователем в день цикла (cd1), чтобы начать первый цикл культивирования капацитации. Если cd1 приходится на выходные, испытуемые свяжутся с медсестрой-исследователем в понедельник. Субъект посетит клинику на 1, 2 или 3 день менструального кровотечения. УЗИ проводится для исключения кист яичников и берется образец крови для гормональной оценки (ХГЧ, ФСГ, ЛГ, Е2, прогестерон). Вечером 3-го дня цикла при первом посещении клиники будет начата гибкая стимуляция гонадотропином для ускорения развития фолликулов. Первая доза HP-hMG 150 МЕ в 14:00. Вторая доза HP-hMG 150 МЕ на следующий день в 14:00. Субъект вернется для УЗИ органов малого таза и анализа крови (ФСГ, ЛГ, Е2, прогестерон) после двух дней стимуляции HP-hMG 150 МЕ (т.е. утром 6-го дня).
  • Для пациентов с кровотечением OCP: на первый, второй, третий или четвертый день кровотечения отмены, которое возникает после прекращения приема OCP, субъект посещает клинику для прохождения УЗИ органов малого таза и берется образец крови для оценки гормонов (ФСГ). , ЛГ, Е2, прогестерон, АМГ, общий сывороточный тестостерон, ГСПГ). В день первого визита в клинику будет начата гибкая стимуляция HP-hMG для ускорения развития фолликулов при первой суточной дозе HP-hMG в 20:00. Субъект вернется для УЗИ органов малого таза и анализа крови (ФСГ, ЛГ, Е2, прогестерон) после двух дней стимуляции HP чМГ.

• Второй визит в клинику на 6-й день (через 2 дня лечения HP-hMG):

  • Если ультразвуковое сканирование показывает наличие одного доминантного фолликула размером более 12 мм, а все остальные фолликулы менее 10 мм, забор ооцитов будет назначен через два дня, между 8:00 и 9:00. Важно сохранить OR через 42–46 часов после последней инъекции HP-hMG в качестве фиксированного времени. Если ультразвуковое сканирование показывает максимальный диаметр фолликула менее 8 мм, последняя инъекция HP-hMG будет вводиться в 14:00. а забор ооцитов (OR) будет запланирован через два дня, между 8:00 и 9:00. Важно сохранить OR через 42–46 часов после последней инъекции HP-hMG в качестве фиксированного времени.
  • Для пациентов с кровотечением OCP: если ультразвуковое сканирование показывает максимальный диаметр фолликула ок. 9 мм, последняя инъекция HP-hMG будет вводиться в 14:00. а забор ооцитов (ОР) будет назначен через два дня, между 8:00 и 9:00 (под общей анестезией - точное время ОР следует обсудить с операционной медсестрой и анестезиологом). Важно поддерживать постоянное время OR на уровне 42-46 часов после последней инъекции HP-hMG.

• Третье посещение – забор ооцитов: забор ооцитов (OR) будет запланирован с 8:00 до 10:00 (под общей анестезией). В день операции:

  • Записывается УЗИ обоих яичников и слизистой оболочки эндометрия.
  • Будет получен образец крови для гормонального профиля (ЛГ, ФСГ, Е2, прогестерон).
• Все кумулюсно-ооцитарные комплексы (КОК), полученные от пациентки, культивируют в среде САРА в течение 24 часов.

• После культивирования CAPA половина ооцитов будет случайным образом (50/50) разделена на среду с двумя триггерами созревания.

  • Группа 1: среда Medicult IVM + AREG+FSH+HSA+инсулин+эстрадиол (группа AREG-TRIGGER)
  • Группа 2: среда Medicult IVM + FSH+GH+hCG+HSA (группа CONTROL-TRIGGER) без добавления AREG

• Созревание ооцитов in vitro:

  • Оцените и зарегистрируйте КОК для массы кумулюса (CM) и контакта кумулюса между ооцитом и клетками кумулюса. Каждый раз фотографируйте. Откажитесь от полностью оголенных, выродившихся ооцитов.
  • С помощью микропипетки Eppendorf перенесите половину КОК (по 5-10 за один раз) из чашки для культивирования капацитации в «чашку для промывания», содержащую «среду для созревания 1 (среда AREG-TRIGGER)», и тщательно промойте их (загрузите наконечники пипетки 5 мкл, макс. 10 мкл). Затем перенесите КОК в «чашку IVM» с «средой для созревания 1 (среда AREG-TRIGGER)».
  • Перенесите вторую половину КОК из чашки для культивирования капацитации в «чашку для промывания», содержащую «среду для созревания 2 (среда CONTROL-TRIGGER)», и тщательно промойте их (загрузите наконечники пипеток 5 мкл, макс. 10 мкл). Затем перенесите КОК в «чашку IVM» с «средой для созревания 2 (среда CONTROL-TRIGGER)».
  • Держите КОК в пулах по ~10.
  • Пометьте чашку соответствующим образом и культивируйте КОК в течение 30-32 часов в инкубаторе.
• Оценка созревания (MII, GVBD, GV) будет проводиться через 30 часов. Ооциты, подвергшиеся GVBD, но без явного PB, будут оцениваться через 32 часа. Осеменение будет проводиться с использованием интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (через 3-4 часа после извлечения ооцитов или проверки их созревания); осеменяют только созревшие ооциты.
• Проверка оплодотворения будет проводиться под инвертированным микроскопом через 16-18 часов после осеменения. Оценка эмбрионов будет проводиться через 68 ± 1 час после оплодотворения с использованием Стамбульского консенсуса. Используется стандартный протокол витрификации эмбрионов. Эмбрионы будут витрифицированы в соответствии с полученным протоколом стимуляции (группа 1 AREG-TRIGGER или группа 2 - CONTROL-TRIGGER).
• Перенос замороженных эмбрионов: пациенты будут рандомизированы для случайного получения эмбрионов от AREG-TRIGGER или CONTROL-TRIGGER. При отсутствии эмбриона(ов) из рандомизированной группы переносили эмбрион(ы) из другой группы.
• Первый тест на беременность был проведен через 14 дней после переноса эмбрионов; положительный тест на беременность определялся как бета-ХГЧ в сыворотке >5 мМЕ/мл.
• Клиническая беременность определялась как наличие хотя бы одного плодного яйца на УЗИ в сроке 7 недель с выявлением активности сердцебиения.
• Текущая беременность определялась как беременность с обнаруживаемой частотой сердечных сокращений на сроке ≥12 недель гестации после завершения первого переноса.
• Живорождение определялось как рождение по крайней мере одного новорожденного после 24 недель беременности, проявляющего какие-либо признаки жизни (двойни учитывались в единственном числе).
• После первого неудачного цикла IVM: будут обсуждаться клинические и эмбриологические данные и результаты, относящиеся к первому циклу IVM (кумулятивные циклы свежих и замороженных эмбрионов), чтобы установить более индивидуальный подход к возможному второму циклу IVM. Индивидуальный подход к пациенту во втором цикле IVM может заключаться в модификации ведения фолликулярной фазы.