Amfiregulin versus neamfiregulinová suplementace do zrajícího kultivačního média v IVM.

V této studii lze rozlišit dva typy pacientů:

• Morfologie polycystických vaječníků + normální délka cyklu (až 35 dní). Většina subjektů v této skupině má nesyndromické polycystické vaječníky a nemají PCOS. U těchto pacientů je AMH pouze mírně zvýšena a pod vlivem FSH dochází k cyklickému vývoji folikulů.
• PCOS – morfologie polycystických vaječníků + oligomenorea (menstruace vyskytující se v intervalech delších než 35 dnů, pouze čtyři až devět menstruací za rok) nebo amenorea. U těchto pacientů s často silně zvýšenými hladinami AMH a současnou hyperandrogenémií vede relativní rezistence k FSH k zastavení růstu folikulů ve stavu malých antrálních folikulů. Spontánní selekce dominantního folikulu se nevyskytuje nebo se vyskytuje zřídka. Velká část folikulů je atretická. Významná část těchto pacientů má BMI vyšší než 25. Tito pacienti obecně dostávají stejný standardní režim stimulace gonadotropiny jako pacienti z předchozí skupiny, ale pokud mají největší folikuly třetí den stimulace průměr menší než 8 mm, pacienti dostávají jeden nebo dva další dny stimulace gonadotropiny. Navíc tito pacienti obvykle užívají dva až tři týdny OCP před začátkem cyklu IVM a stimulaci začnou přibližně v den 5 po vysazení OCP. Nicméně, protože tito pacienti nemají endogenní FSH řízený nábor folikulů, je začátek stimulace spíše flexibilní.
• Užívání OCP (orální antikoncepční pilulky) před IVM cyklem je povinné. OCP (například Microgynon 30 mikrogramů) bude podáván denně, aby se vyčistily atretické folikuly ve vaječníku. OCP bude podáván po dobu 14 až 21 dnů (tato metoda umožňuje lepší programování cyklů a pracovní zátěže v embryologické laboratoři).

Před prvním IVM cyklem (screeningová návštěva): Všechny subjekty podstoupí ultrazvukové vyšetření pánve, aby se vyhodnotila vhodnost podstoupit IVM léčbu. Pacienti podstoupí krevní test na sérologické vyšetření (hepatitida B, HIV, syfilis) a základní hormonální profil (LH, FSH, E2, progesteron, AMH, SHBG, Testosteron). Doplňková analýza TSH, tyreoperoxidázových protilátek, prolaktinu. Jakákoli souběžná medikace užívaná v posledních 3 měsících před pokusem o IVM by měla být oznámena.

První léčebný cyklus IVM:

• První návštěva kliniky:

  • Všechny subjekty budou kontaktovat studijní sestru v den cyklu (cd1), aby zahájily první cyklus kapacitní kultury. Pokud je cd1 během víkendu, subjekty budou kontaktovat studijní sestru v pondělí. Subjekt se dostaví na kliniku 1., 2. nebo 3. den menstruačního krvácení. Provádí se ultrazvukové vyšetření k vyloučení existence ovariálních cyst a odběr krve na hormonální posouzení (HCG, FSH, LH, E2, progesteron). Večer v den cyklu 3 první návštěvy kliniky bude zahájena flexibilní stimulace gonadotropiny, aby se podpořil vývoj folikulů. První dávka HP-hMG 150 IU ve 14 hodin. Druhá dávka HP-hMG 150 IU následující den ve 14:00. Subjekt se vrátí na ultrazvukové vyšetření pánve a krevní test (FSH, LH, E2, progesteron) po dvou dnech stimulace HP-hMG 150 IU (tj. ráno 6. dne).
  • Pro pacienty s krvácením z OCP: První, dva, tři nebo čtyři dny krvácení z vysazení, ke kterému dojde po přerušení OCP, se subjekt dostaví na kliniku, kde podstoupí ultrazvukové vyšetření pánve a odebere se vzorek krve pro hormonální vyšetření (FSH , LH, E2, progesteron, AMH, celkový sérový testosteron, SHBG). V den první návštěvy kliniky bude zahájena flexibilní stimulace HP-hMG pro posílení vývoje folikulů, a to první denní dávkou HP-hMG ve 20 hodin. Subjekt se vrátí na ultrazvukové vyšetření pánve a krevní test (FSH, LH, E2, progesteron) po dvou dnech stimulace HP hMG.

• Druhá návštěva kliniky v den 6 (po 2 dnech léčby HP-hMG):

  • Pokud ultrazvukové vyšetření prokáže přítomnost jediného dominantního folikulu většího než 12 mm, přičemž všechny ostatní folikuly jsou menší než 10 mm, a odběr oocytů (OR) bude naplánován o dva dny později, mezi 8:00 a 9:00. Je důležité dodržet OR 42 - 46 hodin po poslední injekci HP-hMG jako pevné načasování. Pokud ultrazvukové vyšetření ukazuje maximální průměr folikulu menší než 8 mm, bude poslední injekce HP-hMG podána ve 14 hodin. a odběr oocytů (OR) bude naplánován o dva dny později, mezi 8:00 a 9:00. Je důležité dodržet OR 42 - 46 hodin po poslední injekci HP-hMG jako pevné načasování.
  • Pro pacienty s OCP krvácením: Pokud ultrazvukový snímek ukazuje maximální průměr folikulu cca. 9 mm, poslední injekce HP-hMG bude podána ve 14 hodin. a odběr oocytů (OR) bude naplánován o dva dny později, mezi 8:00 a 9:00 h (v celkové anestezii - přesný čas OR je třeba konzultovat s operačními sestrami a anesteziologem). Je důležité udržovat konstantní dobu OR 42-46 hodin po poslední injekci HP-hMG.

• Třetí návštěva - Odběr oocytů: Odběr oocytů (OR) bude naplánován mezi 8:00 a 10:00 h (v celkové anestezii). V den NEBO:

  • Zaznamená se ultrazvukové vyšetření obou vaječníků a endometriální výstelky.
  • Bude odebrán vzorek krve pro hormonální profilování (LH, FSH, E2, progesteron).
• Všechny komplexy cumulus-oocyte (COC) získané od pacienta se kultivují v médiu CAPA po dobu 24 hodin.

• Po kultivaci CAPA bude polovina oocytů rozdělena náhodně (50/50) do dvou spouštěcích médií zrání.

  • Skupina 1: Medicult IVM média + AREG+FSH+HSA+inzulin+estradiol (skupina AREG-TRIGGER)
  • Skupina 2: Medicult IVM media + FSH+GH+hCG+HSA (skupina CONTROL-TRIGGER) bez přidání AREG

• Zrání oocytů in vitro:

  • Vyhodnoťte a registrujte COC pro cumulus mass (CM) a kontakt kumulu mezi oocytem a buňkami kumulu. Pokaždé fotografujte. Zlikvidujte zcela obnažené, degenerované oocyty.
  • Přeneste polovinu COC (5-10 najednou) z misky s kulturou Capacitation do "mycí misky" obsahující "Maturation Medium 1 (AREG-TRIGGER medium)" pomocí mikropipety Eppendorf a důkladně je promyjte (špičky pipet naplňte 5 µl, max. 10 ul). Poté přeneste COC do "IVM misky" s "Maturation Medium 1 (AREG-TRIGGER medium)".
  • Přeneste druhou polovinu COC z kapacitní kultivační misky do "mycí misky" obsahující "Maturation Medium 2 (CONTROL-TRIGGER medium)" a důkladně je promyjte (naplňte špičky pipet 5 µl, max. 10 ul). Poté přeneste COC do "IVM misky" s "Maturation Medium 2 (CONTROL-TRIGGER medium)".
  • Uchovávejte COC v bazénech po ~10.
  • Misky vhodně označte a kultivujte COC 30-32 hodin v inkubátoru.
• Hodnocení zrání (MII, GVBD, GV) bude provedeno ve 30 hodin. Oocyty, které prošly GVBD, ale bez jasné PB, budou hodnoceny po 32 hodinách. Inseminace bude provedena pomocí intracytoplazmatické injekce spermie (3-4 hodiny po odběru oocytů nebo kontrole zrání); budou inseminovány pouze zralé oocyty.
• Kontrola oplodnění bude provedena pod inverzním mikroskopem 16-18 hodin po inseminaci. Hodnocení embryí bude provedeno 68 ±1 hodin po oplodnění pomocí Istanbulského konsenzu. Použitý standardní protokol vitrifikace embryí. Embrya budou vitrifikována podle získaného stimulačního protokolu (skupina 1 AREG-TRIGGER nebo skupina 2 - CONTROL-TRIGGER).
• Přenos zmrazeného embrya: Pacient bude randomizován tak, aby náhodně obdržel embryo z AREG-TRIGGER nebo CONTROL-TRIGGER. Pokud nebylo k dispozici žádné embryo (embrya) z randomizované skupiny, byla přenesena embrya (embrya) z druhé skupiny.
• První těhotenský test byl proveden 14 dní po embryotransferu; pozitivní těhotenský test byl definován jako sérový beta hCG > 5 mIU/ml
• Klinické těhotenství bylo definováno jako alespoň jeden gestační váček na ultrazvuku v 7. týdnu gestace s detekcí srdeční aktivity.
• Probíhající těhotenství bylo definováno jako těhotenství s detekovatelnou srdeční frekvencí v ≥12 týdnech gestace po dokončení prvního převodu.
• Živé porody byly definovány jako narození alespoň jednoho novorozence po 24. týdnu gestace, které vykazovalo jakékoli známky života (dvojčata byla jedním počtem).
• Po prvním neúspěšném cyklu IVM: Budou diskutována klinická a embryologická data a výsledky související s prvním cyklem IVM (kumulativní cykly čerstvého a zmrazeného embrya), aby se stanovil přístup více přizpůsobený pacientovi pro případný druhý cyklus IVM. Přístup přizpůsobený pacientovi ve druhém cyklu IVM může sestávat z modifikace managementu folikulární fáze.