Skuteczność i bezpieczeństwo terapii skojarzonej izotretynoiną i niektórymi lekami przeciwgrzybiczymi jako potencjalnej terapii aerozolowej w przypadku COVID-19: innowacyjne podejście terapeutyczne COVID-19 (Isotretinoin)

Jest to małe badanie pilotażowe mające na celu sprawdzenie, czy istnieje jakikolwiek sygnał skuteczności terapii skojarzonej izotretynoiną i niektórymi lekami przeciwgrzybiczymi w leczeniu COVID-19, który uzasadnia większe badanie fazy III, lub jakiekolwiek szkody sugerujące, że takiego badania nie należy przeprowadzać. Oczekuje się, że przyniesie statystycznie istotne wyniki w głównych punktach końcowych. Badacz zbada wszystkie dane biologiczne, fizjologiczne i kliniczne, aby ustalić, czy badanie III fazy jest uzasadnione.

Pierwotna analiza skuteczności zostanie przeprowadzona tylko u pacjentów otrzymujących co najmniej 4 dawki aktywnego leku złożonego. Analiza bezpieczeństwa zostanie przeprowadzona u wszystkich pacjentów otrzymujących co najmniej jedną dawkę aktywnego leku.

wprowadzanie

W Wuhan w prowincji Hubei w Chinach zgłoszono przypadki ostrej infekcji dróg oddechowych w grudniu 2019 r.1,2 Chińskie Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) początkowo poinformowało, że przyczyną tej choroby jest koronawirus zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), następnie uznano go za nowy koronawirus. Choroba ta została uznana przez WHO za chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19), która szybko rozprzestrzenia się w innych miastach Chin i po jej globalnym rozprzestrzenieniu stała się zagrożeniem zdrowia publicznego o zasięgu międzynarodowym (PHEIC). Objawy kliniczne COVID-19 to gorączka, kaszel, ból mięśni, zmęczenie, biegunka i zapalenie płuc, które w ciężkich przypadkach mogą spowodować śmierć.4Chiny zgłosiło 72436 przypadków potwierdzonego COVID-19 i 1868 zgonów do 18 lutego 2020 r.5 Wrodzony układ odpornościowy stanowi pierwszą linię obrony i inicjuje przeciwdziałające odpowiedzi, które chronią gospodarza przed infekcją wirusową poprzez ewolucyjnie konserwowane receptory rozpoznawania wzorców (PRR) 6. PRR obejmują związane z błoną receptory Toll-podobne (TLR) i czujniki cytozolowe, takie jak jako receptory podobne do genu indukowalnego kwasem retinowym (RIG-I) (RLR), które wykrywają wirusy RNA 6. RIG-I specyficznie wykrywa wewnątrzkomórkowy dwuniciowy wirusowy RNA zawierający struktury 5' trifosforanowe i żeńskie w celu aktywacji sygnalizacji przeciwwirusowej7,8. Gdy wirus zaatakuje gospodarza, PRR przekazują sygnały do ​​dalszych kinaz, które aktywują czynniki transkrypcyjne, w tym czynnik regulatorowy IFN-3 (IRF3), czynnik jądrowy κB (NF-κB) i ATF-2/c-jun, z pomocą różnych cząsteczek adaptorowych (MAVS/IPS-1/VISA/Cardif dla RIG-I, TRIF dla TLR3 i MyD88 dla TLR7/8/9) w celu aktywacji produkcji IFN9,10,11. Wirusy wyewoluowały skomplikowane mechanizmy unikania lub dezaktywować wrodzoną ścieżkę sygnalizacji immunologicznej dla ich replikacji 12. Zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (SARS) to wysoce zaraźliwa choroba układu oddechowego, która pojawiła się po raz pierwszy w Chinach w 2002 roku i zaraziła ponad 8000 osób na całym świecie i zabiła około 800 zakażonych. Koronawirus SARS (SARS-CoV) ma jednoniciowy, dodatnio sensowny genom RNA o wielkości około 29,7 kb 13,14. Liczne badania wykazały, że SARS-CoV rozwija mechanizm antagonistyczny, aby uniknąć przeciwwirusowego działania IFN 15 Zakażenie SARS-CoV-2 może prowadzić do nadmiernej produkcji cytokin prozapalnych, ale produkcja interferonów typu I, które są kluczowymi czynnikami przeciwwirusowymi mediatorów, jest podobno stępiony; Poprzednie badania sugerowały, że proteaza podobna do papainy SARS-CoV (PLpro) hamuje aktywację szlaku IRF3, co normalnie wywołałoby silną odpowiedź IFN, ale mechanizm (mechanizmy) stosowany przez SARS PLpro do hamowania aktywacji szlaku IRF3 nie jest w pełni znany.16 Jako kluczowe składniki natychmiastowej odpowiedzi przeciwwirusowej, interferony typu I mają kluczowe znaczenie dla ograniczenia replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa poprzez autokrynną i parakrynną sygnalizację receptora IFN typu I (IFNAR). Interferony typu 1 mają szerokie działanie przeciwwirusowe in vitro i są obecnie oceniane w badaniu klinicznym w leczeniu MERS-CoV. Jednak minimalne ilości IFN wykryto we krwi obwodowej lub płucach pacjentów z ciężkim COVID-19 17,18 W mysim modelu zakażenia SARS-CoV, lokalne odpowiedzi IFN w płucach były opóźnione w stosunku do szczytowej replikacji wirusa, co utrudniało usuwanie wirusa i było związane z rozwojem CRS19. SARS-CoV-2 ORF3b jest silnym inhebitorem i antagonistą interferonu 20 Rozregulowane odpowiedzi IFN wskazują na skuteczne strategie immunomodulacyjne stosowane przez betakoronawirusy. Podczas fazy inkubacji SARS-CoV-2 replikuje się ukradkiem w komórkach gospodarza bez wykrywalnego wyzwalania IFN, co prowadzi do wysokiego miana wirusa1. Wiadomo, że koronawirusy indukują tworzenie błoniastych przedziałów przeznaczonych do syntezy wirusowego RNA, a tym samym ukrywają wzorce molekularne związane z patogenami wirusowymi (PAMP; na przykład wirusowe RNA) przed wykryciem przez receptory rozpoznawania wzorców gospodarza (PRR), takie jak RIG-I i MDA5. Ponadto wiadomo, że kilka konserwatywnych białek betakoronawirusa, głównie białek niestrukturalnych (nsps), wywiera bezpośrednie działanie antagonistyczne wobec IFN. Niektóre modyfikują specyficzne cechy wirusowego RNA (katalizując metylację guanozyny-N7 i rybozy-2'-O), aby uniknąć rozpoznania przez określone PRR (na przykład nsp14 i nsp16), podczas gdy inne, takie jak nsp3 i nsp1, hamują sygnał transdukcja, w której pośredniczą odpowiednio PRR i IFNAR19

--Wpływ TLR3 na IFN typu I

Receptory Toll-podobne (TLR) to klasa receptorów rozpoznających wzorce (PRR), które inicjują wrodzoną odpowiedź immunologiczną na inwazyjne patogeny poprzez wykrywanie konserwatywnych wzorców molekularnych w celu wczesnego rozpoznania immunologicznego patogenów, takich jak wirusy, bakterie i grzyby, w celu zainicjowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na atakujące patogeny. Ponadto TLR odgrywają ważną rolę w naprawie tkanek i stanach zapalnych wywołanych uszkodzeniem tkanek. Pojawienie się wysoce zjadliwych koronawirusów zespołu ostrej niewydolności oddechowej (MERSCoV) stanowi problem dla zdrowia publicznego na całym świecie, ponieważ brakuje skutecznych platform szczepionek i przeciwwirusowych strategii terapeutycznych21. Badanie wykazało, że wstępna stymulacja TLR3 kwasem poliinozynypolicytydylowym (poli I:C) hamowała infekcję MHV poprzez indukcję INF-β w makrofagach. 22 Badanie wykazało, że TLR3(-/-), TLR4(-/-) i Myszy TRAM (-/-) są bardziej podatne na SARS-CoV niż myszy typu dzikiego, ale doświadczają jedynie przejściowej utraty wagi bez śmiertelności w odpowiedzi na infekcję. W przeciwieństwie do tego myszy z niedoborem adaptera TLR3 / TLR4 TRIF są bardzo podatne na zakażenie SARS-CoV, wykazując zwiększoną utratę masy ciała, śmiertelność, zmniejszoną czynność płuc, zwiększoną patologię płuc i wyższe miana wirusa. Chen wykazał wysoki poziom IFN-α/β wytwarzanego ze szlaku TLR3-IRF3/IRF7, a IFN-β jest przyczyną hamowania replikacji DENV. W komórkach HUH-7 huTLR3 może rozpoznawać DENV-1 i indukować ekspresję IFN-β, który może zwiększać ekspresję huTLR3, wręcz przeciwnie. TLR3 indukuje również IFN typu I podczas WNV..21

--Wpływ kwasu izotretynoiny 13 cis retinowego na TLR3 i TLR-2

Wiadomo, że wiele genów o znacznej regulacji w górę jest genami reagującymi na retinoidy, w tym: odpowiedź na kwas retinowy 1 [gen indukowany tazarotenem 1 (TIG1)}, komórkowe białko wiążące retinol 1 i komórkowe białko wiążące kwas retinowy 2. Ponadto, wapń- białka wiążące (tj. Białka S100), proteazy serynowe, inhibitory proteazy serynowej (serpiny), lipokalina i nośniki substancji rozpuszczonej były znacząco zmienione przez 13-cis RA25. Ponadto analiza ekspresji genów w sebocytach SEB-1 i keratynocytach HaCaT z 72-godzinnym leczeniem 13-cis RA. Ujawniono, że nastąpiły zmiany w kilku genach zaangażowanych w apoptozę i wrodzoną odporność, takich jak białko 2 indukowane TNFα, TRAIL, czynnik regulujący interferon 1 (IRF1), białka indukowane interferonem, NFκB, receptor śmierci, Fas i TIG3 (aka. gen indukowany kwasem retinowym 1 (RIG1)). TIG3 koduje helikazę RNA i reprezentuje kluczowe białko wewnątrzkomórkowe, które podobnie jak TLR3 może rozpoznawać wirusowe dwuniciowe RNA (dsRNA). 26 izotretynoina może hamować burzę cytokin dokładnie inhebtion TLR-2 Jak wykazano, że leczenie pacjentów izotretynoiną znacząco zmniejszyło ekspresję monocytów TLR-2 i późniejszą zapalną odpowiedź cytokin na P. acnes po 1 tygodniu terapii. Efekt ten utrzymywał się 6 miesięcy po zaprzestaniu leczenia, co wskazuje, że modulacja TLR-2 może być zaangażowana w trwałą odpowiedź terapeutyczną na izotretynoinę.22 Przeciwnie, kwas 13Cis retinowy indukował znaczną regulację w górę receptora toll-podobnego 3 (TLR3), mitochondrialnego przeciwwirusowego białka sygnałowego (MAVS) i indukowanego przez retinoid genu I (RIG-I) oraz ekspresję czynnika regulacyjnego IFN 1 w zależności od czasu. 23 może to skutkować odpowiedzią immunologiczną na pośredni dsRNA, który może być częściowo generowany podczas replikacji CoV-2. Wytwarzanie IFN typu I jest ważne dla zwiększenia uwalniania białek przeciwwirusowych w celu ochrony niezainfekowanych komórek. Czasami białka pomocnicze CoV mogą zakłócać sygnalizację TLR3 i wiązać dsRNA CoV podczas replikacji, aby zapobiec aktywacji TLR3 i uniknąć odpowiedzi immunologicznej. Czynnik regulujący interferon 1 (IRF1) został zidentyfikowany jako krytyczny czynnik pośredniczący w indukcji TRAIL przez kwas retinowy w komórkach białaczki NB4 APL i komórkach raka piersi SK-BR-3. Co ciekawe, 13-cis RA znacznie zwiększa ekspresję genu IRF1 (2,42-krotny wzrost) w sebocytach SEB-1 27

Wpływ leków przeciwgrzybiczych na indukcję efektu i stężenia izotretynoiny w tkankach docelowych

Itrakonazol i flukonazol to leki przeciwgrzybicze z pierścieniem triazolowym, które są wielopierścieniowymi syntetycznymi związkami zawierającymi trzy atomy azotu. Z drugiej strony wykazano, że azolowe leki przeciwgrzybicze hamują enzymy cytochromu P450 28. celem leku jest zwiększenie stężenia retinoidu w docelowych komórkach31 Inhibitory CYP26 zwiększają sygnalizację retinoidową w komórkach mięśni gładkich błony wewnętrznej32 Itrakonazol ma mniej właściwości hamujących niż imidazole w mikrosomach wątroby szczura 29. ICZ zakłóca szlak syntezy ergosterolu w komórce gospodarza i hamuje enzymy cytochromu P450, w szczególności enzym cyp 34, który metabolizuje kwas retinowy w komórkach ludzkich, co zwiększa stężenie kwasu retinowego w docelowych komórkach ssaków40, prowadząc do aktywacji receptorów podobnych do TOLL indukując jego mechanizm przeciwwirusowy do indukowania poziomów ekspresji IFN typu I w kierunku indukcji stanu preaktywowanego, przyspieszając w ten sposób indukowaną wirusem odpowiedź komórki gospodarza41 IFN mogą służyć jako pierwsza linia obrony immunologicznej przed infekcjami wirusowymi.41 IFN to bardzo silne cytokiny, które odgrywają kluczową rolę w zwalczaniu patogennych infekcji poprzez kontrolowanie stanu zapalnego i odpowiedzi immunologicznej poprzez bezpośrednie indukowanie molekularnych środków zaradczych przeciwko patogenom.42 Istnieje są trzy klasy IFN: typ I, typ II i typ III. Chociaż wykazano, że flukonazol jest silnym inhibitorem cytochromu P450 30, sugerujemy, że jest to lek przeciwgrzybiczy. Flukonazol lub itrakonazol mogą hamować enzymy cytochromu P450, zwłaszcza cype 26, które kontrolują stężenie kwasu retinowego w ludzkich komórkach przeciwgrzybicze mogą zwiększać zarówno działanie izotretynoiny, jak i stężenie w tkankach docelowych To z kolei prowadzi do hiperindukcji i syntezy interferonu w przypadku COVID-19 Abadanie wykazało, że Wykazano, że flukonazol jest silnym inhibitorem cytochromu P450. . Ponieważ stosowanie izotretynoiny wzrasta, ważne jest, aby lekarze byli świadomi działań niepożądanych, toksyczności i problemów związanych z zarządzaniem jej stosowaniem. Najważniejszą kwestią są wady wrodzone, co zaowocowało nową polityką i programami zapobiegania ciąży wdrażanymi przez producenta. Stosunkowo nowym problemem jest depresja związana ze stosowaniem izotretynoiny, co również skutkuje nowymi zasadami wprowadzonymi przez producenta i FDA. Jednak tutaj, w naszym przeglądzie, zdecydowanie zalecamy, aby każdy badacz, który chce stosować izotrytynoinę klinicznie covid-19 jego kliniczny badanie musi być małym badaniem pilotażowym mającym na celu zbadanie, czy istnieje jakikolwiek sygnał dotyczący skuteczności, który uzasadnia większe badanie fazy 2B, lub jakiekolwiek szkody sugerujące, że takiego badania nie należy przeprowadzać. Badacz zbada wszystkie dane biologiczne, fizjologiczne i kliniczne, aby ustalić, czy badanie fazy 2B jest uzasadnione. I musi też przestrzegać tych zasad: Izotretynoina musi być podawana w postaci aerozolu drogą oddechową, aby miała działanie skupione tylko na komórkach płuc i nie wpływała na inne narządy. Inhalacja aerozolu może osadzać lek bezpośrednio na populacji komórek zatrzymanych we wczesnej fazie raka, potencjalnie osiągając znacznie większą skuteczność w porównaniu z poleganiem na dyfuzji z krwi. Bezpośrednie podanie kwasu retinowego w aerozolu na nabłonek płuc może uniknąć znacznej części wiązania z białkami i poważnych skutków ubocznych na inne narządy, zwłaszcza na narządy wrodzone, co znacznie zwiększa siłę działania w miejscu docelowym.35 Ponieważ badanie na królikach wykazało, że izotretynoina może być podawana w postaci aerozolu bez poważnych skutków ubocznych. Powtarzane wysokie dawki 13 cis retinoiku przez inhalację powodowały umiarkowaną utratę masy ciała, ale badanie mikroskopowe drogi inhalacji dziesięciu tkanek bez uszkodzeń w płucach, w tym w płucach i przełyku, nie wykazało żadnych istotnych uszkodzeń wywołanych aerozolem, dlatego wziewna izotretynoina może zapewnić wystarczającą ilość leku do komórek docelowych w płucach w celu uzyskania skuteczności przy jednoczesnym uniknięciu toksyczności ogólnoustrojowej. W tym badaniu 148 pacjentów z pięciu szpitali uniwersyteckich zostało zrekrutowanych i losowo przydzielonych do grupy otrzymującej ATRA w małej dawce (1 mg/kg mc./dobę przez 4 dni w tygodniu) lub dużej dawce (2 mg/kg mc./dobę przez 4 dni w tygodniu). , kwas 13-cis-retinowy (1 mg/kg/dzień, codziennie) lub placebo przez 6 miesięcy, po czym nastąpiła 3-miesięczna faza krzyżowa. Następnie obserwowano ich przez dodatkowe 9 miesięcy przed ostateczną oceną. W badaniu wykazano, że retinoidy (kwas 13 cis-retinowy) są bezpieczne, ponieważ zdarzenia niepożądane związane z lekiem były na ogół łagodne.37 Ponadto izotretynoina w aerozolu musi być podawana w małych dawkach dostosowanych do masy ciała pacjenta, a także stopniowo zagęszczana przez krótki okres nieprzekraczający 14 dni od daty podania pierwszej dawki. uważa się za leczenie przewlekłe i kwas 13 cis retinowy w aerozolu należy podawać stopniowo w jednej dawce dziennej zwiększa się z 0,2 mg/kg mc./dobę do 2 mg/kg mc./dobę w postaci inhalacji terapia kwasem 13 cis retinowym przez 14 dni Badanie wykazało, że stosowanie układu kwasu retinowego w aerozolu doprowadziło do wzrostu poziomu kwasu retinowego w płucach, ale nie w wątrobie ani w osoczu. Komórkowe poziomy retinolu, palmitynianu retinylu i stearynianu retinylu w płucach również wydawały się być niezmienione (odpowiednio 245,6 ± 10,7, 47,4 ± 3,4 i 132,8 ± 7,7 ng·g-1 mokrej masy). Wykazano również, że zastosowanie tego kwasu retinowego w aerozolu indukowało również zależną od dawki ekspresję białka komórkowego wiążącego retinol 1 (CRBP-1) w płucach, bez widocznych szkodliwych skutków ubocznych.38 Chociaż więcej niż jedno badanie kliniczne wykazało bezpieczeństwo i niepoważne działania niepożądane ogólnoustrojowego izotretynonu, zdecydowanie zalecamy, aby izotretynoina była podawana w postaci aerozolu przez krótki okres leczenia i z małymi stopniowymi dawkami do docelowych komórek płuc tylko w celu uniknięcia potencjalnego skutki uboczne. Badanie kliniczne przeprowadzone na 1166 pacjentach w ramach dokładnego badania fazy III (NCI #I91-0001) w National Cancer Institute (NCI) wykazało, że po medianie czasu obserwacji wynoszącej 3,5 roku nie było statystycznie istotnych różnic między grupą otrzymującą placebo i izotretynoinę w odniesieniu do czasu do SPT, nawrotów lub śmiertelności. W tym badaniu Pacjenci zostali losowo przydzieleni do otrzymywania placebo lub izotretynoiny retinoidu (30 mg/dobę) przez 3 lata metodą podwójnie ślepej próby. Podczas randomizacji pacjentów stratyfikowano według stadium nowotworu, histologii i statusu palenia. Pierwszorzędowy punkt końcowy (czas do SPT) i drugorzędowe punkty końcowe (czas do nawrotu i zgonu) analizowano za pomocą testu log-rank i modelu proporcjonalnego ryzyka Coxa. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne.34 Badanie przeprowadzone na 720 pacjentach, którzy otrzymali jeden lub więcej cykli leczenia doustną izotretynoiną i których średni okres obserwacji wynosił 4,9 roku (zakres 2/12 lat). Większość pacjentów (442) otrzymała całkowitą dawkę skumulowaną 120/200 mg/kg masy ciała. Sto sześćdziesięciu dwóch pacjentów otrzymało skumulowaną dawkę

Bezpieczeństwo aerozolu flukonazolu

Badanie wykazało, że flukonazol można podawać drogą inhalacji. Terapia grzybiczych chorób układu oddechowego wciąż stoi przed wyzwaniami wynikającymi z coraz częstszych chorób autoimmunologicznych, nowotworów i stosowania leków immunosupresyjnych. Flukonazol jest lekiem przeciwgrzybiczym o szerokim spektrum działania i nadal jest z powodzeniem stosowany w leczeniu zakażeń oportunistycznych w połączeniu z innymi lekami przeciwgrzybiczymi. Ponieważ leczenie chorób grzybiczych układu oddechowego wymaga długotrwałej hospitalizacji; może zwiększyć ryzyko innych infekcji oportunistycznych. Biorąc pod uwagę zgłaszaną lekooporność i działania niepożądane podawania ogólnoustrojowego, wydaje się, że miejscowa terapia przeciwgrzybicza płuc może być odpowiednią drogą alternatywną. Zgodnie z podanymi odpowiednimi właściwościami inhalacyjnymi suszonych rozpyłowo proszków; Do przygotowania proszków flukonazolu zastosowano technikę suszenia rozpyłowego.39