Eficácia e segurança da terapia combinada de isotretinoína e alguns antifúngicos como uma potencial terapia de aerossol para COVID-19: uma abordagem terapêutica inovadora COVID-19 (Isotretinoin)

Este é um pequeno estudo piloto que investiga se há algum sinal de eficácia da terapia combinada de isotretinoína e alguns medicamentos antifúngicos no tratamento de COVID-19 que justifique um estudo maior de Fase III ou qualquer dano que sugira que tal estudo não deva ser feito. Espera-se que produza resultados estatisticamente significativos nos principais parâmetros. O investigador examinará todos os dados biológicos, fisiológicos e clínicos para determinar se um estudo de Fase III é justificado.

A análise de eficácia primária será realizada apenas em pacientes recebendo pelo menos 4 doses da droga de combinação ativa. A análise de segurança será realizada em todos os pacientes recebendo pelo menos uma dose do medicamento ativo.

introdução

Em Wuhan, província de Hubei, China, foram notificados casos de infecção respiratória aguda em dezembro de 2019.1,2 O Centro Chinês de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), inicialmente informou que a causa desta doença é o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), então é considerado um novo coronavírus.3Agora, Esta doença, designada pela OMS como doença de coronavírus 2019 (COVID-19), que se espalha rapidamente para outras cidades da China e se tornou uma emergência de saúde pública de interesse internacional (PHEIC) após sua disseminação global. As manifestações clínicas da COVID-19 são febre, tosse, dores musculares, fadiga, diarreia e pneumonia, podendo causar a morte em casos graves.4China relatou 72.436 casos de COVID-19 confirmados e 1.868 mortes até 18 de fevereiro de 2020.5 O sistema imunológico inato representa a primeira linha de defesa e inicia respostas contraativas que protegem o hospedeiro da infecção viral por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRR) 6 conservados evolutivamente. como receptores semelhantes ao gene I (RIG-I) induzíveis por ácido retinóico (RLRs), que detectam vírus de RNA 6. RIG-I detecta especificamente o RNA viral de fita dupla intracelular contendo trifosfato 5' e estruturas panhandle para ativar a sinalização antiviral7,8. Uma vez que um hospedeiro é invadido por um vírus, os PRRs transmitem sinais para as quinases downstream que ativam fatores de transcrição, incluindo fator regulatório IFN-3 (IRF3), fator nuclear κB (NF-κB) e ATF-2/c-jun, com a ajuda de diferentes moléculas adaptadoras (MAVS/IPS-1/VISA/Cardif para RIG-I, TRIF para TLR3 e MyD88 para TLR7/8/9) para ativar a produção de IFN9,10,11. Os vírus desenvolveram mecanismos elaborados para escapar ou inativar a via de sinalização imune inata para sua replicação 12. A síndrome respiratória aguda grave (SARS) é uma doença respiratória altamente contagiosa que apareceu pela primeira vez na China em 2002 e infectou mais de 8.000 pessoas em todo o mundo e matou cerca de 800 das pessoas infectadas. O coronavírus SARS (SARS-CoV) possui um genoma de RNA de sentido positivo de fita simples de aproximadamente 29,7 kb 13,14. Numerosos estudos revelaram que o SARS-CoV desenvolve um mecanismo antagônico para escapar das atividades antivirais do IFN 15 mediadores, é supostamente embotado; Estudos anteriores sugeriram que a protease semelhante à papaína (PLpro) do SARS-CoV inibe a ativação da via IRF3, que normalmente provocaria uma resposta IFN robusta, mas o(s) mecanismo(s) usado(s) pelo SARS PLpro para inibir a ativação da via IRF3 não está totalmente conhecido.16 Como componentes-chave da resposta antiviral imediata, os interferons tipo I são cruciais para restringir a replicação e disseminação viral, por meio da sinalização autócrina e parácrina do receptor IFN tipo I (IFNAR). Os interferons tipo 1 têm ampla atividade antiviral in vitro e atualmente são avaliados em um ensaio clínico para tratar MERS-CoV. No entanto, quantidades mínimas de IFNs foram detectadas no sangue periférico ou pulmões de pacientes com COVID-19 grave 17,18 modelo de camundongo de infecção por SARS-CoV, as respostas locais de IFN nos pulmões foram atrasadas em relação ao pico de replicação viral, o que impediu a eliminação do vírus e foi associado ao desenvolvimento de CRS19. O SARS-CoV-2 ORF3b é um potente inibidor e antagonista do interferon 20. As respostas desreguladas do IFN são indicativas das estratégias imunomoduladoras eficazes usadas pelos betacoronavírus. Durante a fase de incubação, o SARS-CoV-2 se replica furtivamente nas células hospedeiras sem desencadear IFNs de forma detectável, levando a altas cargas virais1. Sabe-se que os coronavírus induzem a formação de compartimentos membranosos dedicados à síntese de RNA viral e, assim, ocultam padrões moleculares associados a patógenos virais (PAMPs; por exemplo, RNAs virais) da detecção por receptores de reconhecimento de padrão do hospedeiro (PRRs), como RIG-I e MDA5. Além disso, várias proteínas de betacoronavírus conservadas, proteínas predominantemente não estruturais (nsps), são conhecidas por exercer atividades antagonistas de IFN diretas. Alguns modificam características específicas do RNA viral (catalizando a metilação da guanosina-N7 e da ribose-2'-O) para evitar o reconhecimento por PRRs específicos (por exemplo, nsp14 e nsp16), enquanto outros, como nsp3 e nsp1, inibem o sinal transdução mediada por PRRs e por IFNAR, respectivamente19

--Impacto de TLR3 em IFNs tipo I

Toll-like receptors (TLRs) são uma classe de receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) que iniciam a resposta imune inata a patógenos invasores, detectando padrões moleculares conservados para o reconhecimento imunológico precoce de patógenos como vírus, bactérias e fungos para iniciar a resposta imune inata a patógenos invasores. Além disso, os TLRs desempenham um papel importante no reparo de tecidos e na inflamação induzida por lesão de tecidos. O surgimento de coronavírus da síndrome respiratória aguda grave altamente patogênico (MERSCoV) é uma preocupação para a saúde pública global, pois há falta de plataformas de vacinas eficazes e estratégias terapêuticas antivirais21. Um estudo demonstrou que a pré-estimulação de TLR3 polyinosini- ácido policitidílico (poli I:C) impediu a infecção por MHV através da indução de INF-β em macrófagos 22 Um estudo demonstrou que TLR3(-/-), TLR4(-/-) e Os camundongos TRAM (-/-) são mais suscetíveis ao SARS-CoV do que os camundongos do tipo selvagem, mas experimentam apenas perda de peso transitória sem mortalidade em resposta à infecção. Em contraste, camundongos deficientes no adaptador TLR3/TLR4 TRIF são altamente suscetíveis à infecção por SARS-CoV, apresentando aumento da perda de peso, mortalidade, redução da função pulmonar, aumento da patologia pulmonar e títulos virais mais altos. Chen mostrou o alto nível de IFN-α/β produzido a partir da via TLR3-IRF3/IRF7 e o IFN-β é a razão para inibir a replicação do DENV. Em células HUH-7, huTLR3 pode reconhecer DENV-1 e induzir a expressão de IFN-β, que pode aumentar a expressão de huTLR3 ao contrário. TLR3 também induz tipo I IFN durante WNV..21

--Impacto do ácido isotretinoína 13 cis retinóico em TLR3 e TLR-2

Muitos dos genes significativamente regulados positivamente são conhecidos por serem genes responsivos a retinóides, incluindo: respondedor de ácido retinóico 1 [gene 1 induzido por tazaroteno (TIG1)}, proteína de ligação de retinol celular 1 e proteína de ligação de ácido retinóico celular 2. Além disso, cálcio- proteínas de ligação (ou seja, Proteínas S100), proteases de serina, inibidores de protease de serina (serpinas), lipocalina e transportadores de soluto foram significativamente afetados por 13-cis RA25 Além disso, análise de expressão gênica em sebócitos SEB-1 e queratinócitos HaCaT com tratamento de 72 horas com 13-cis RA. Revelou que houve alterações em vários genes envolvidos na apoptose e na imunidade inata, como proteína 2 induzida por TNFα, TRAIL, fator regulador de interferon 1 (IRF1), proteínas induzidas por interferon, NFκB, o receptor de morte, Fas e TIG3 (a.k.a. gene 1 induzível por ácido retinóico (RIG1)). O TIG3 codifica uma helicase de RNA e representa uma proteína intracelular chave que, como o TLR3, pode reconhecer o RNA viral de fita dupla (dsRNA). 26 A isotretinoína pode inibir a tempestade de citocinas por meio da inibição completa de TLR-2. Um estudo demonstrou que o tratamento de pacientes com isotretinoína diminuiu significativamente a expressão de monócitos TLR-2 e a subsequente resposta inflamatória de citocinas a P. acnes após 1 semana de terapia. Este efeito foi sustentado 6 meses após a interrupção da terapia, indicando que a modulação TLR-2 pode estar envolvida na resposta terapêutica duradoura à isotretinoína.22 Ao contrário, o ácido 13Cis retinóico induziu uma regulação positiva significativa do receptor toll-like 3 (TLR3), da proteína de sinalização antiviral mitocondrial (MAVS) e do gene I induzido por retinoide (RIG-I) e expressão do fator regulador IFN 1 em um tempo dependente. 23 isso pode resultar em uma resposta imune ao intermediário dsRNA que pode ser parcialmente gerado durante a replicação do CoV-2TLR3 sensibilizado por dsRNA e cascatas de vias de sinalização (ativação de IRFs e NFκB, respectivamente) são ativadas para produzir IFNs tipo I. A produção de IFNs tipo I é importante para aumentar a liberação de proteínas antivirais para a proteção de células não infectadas. Às vezes, as proteínas acessórias do CoV podem interferir na sinalização do TLR3 e ligar o dsRNA do CoV durante a replicação para impedir a ativação do TLR3 e evitar a resposta imune. O fator regulador de interferon 1 (IRF1) foi identificado como um fator crítico na mediação da indução de TRAIL pelo ácido retinóico em células de leucemia NB4 APL e células de câncer de mama SK-BR-3. Curiosamente, o 13-cis RA aumenta significativamente a expressão do gene IRF1 (aumento de 2,42 vezes) em sebócitos SEB-1 27

Impacto das drogas antifúngicas na indução do efeito da isotretinoína e na concentração nos tecidos-alvo

O itraconazol e o fluconazol são antifúngicos triazólicos com anéis azólicos, que são compostos sintéticos multianéis contendo três átomos de nitrogênio Por outro lado, os antifúngicos azólicos demonstraram inibir o citocromo P450 28. alvos de drogas para aumentar as concentrações de retinoide nas células-alvo31 Inibidores do CYP26 aumentam a sinalização do retinóide nas células musculares lisas da íntima32 O itraconazol tem menos propriedades inibidoras do que os imidazóis nos microssomos do fígado de ratos 29. ICZ interfere com a via de síntese de ergosterol da célula hospedeira e inibe as enzimas do citocromo P450, particularmente a enzima cyp 34 que metaboliza o ácido retinóico em células humanas que aumentam a concentração de ácido retinóico em células alvo de mamíferos40 levando à ativação de receptores do tipo TOLL induzindo seu mecanismo antiviral para induzir os níveis de expressão de IFN tipo I para a indução de um estado pré-ativado, acelerando assim a resposta da célula hospedeira induzida por vírus41 Os IFNs podem servir como a primeira linha de defesa imunológica contra infecções virais.41 Os IFNs são citocinas muito poderosas, que desempenham um papel fundamental no combate a infecções patogênicas, controlando a inflamação e a resposta imune por meio da indução direta de contramedidas moleculares antipatógenos.42Há Existem três classes de IFNs: tipo I, tipo II e tipo III. Embora o fluconazol tenha se mostrado um potente inibidor do citocromo P450 30 Aqui, sugerimos isso por ser um antifúngico. O fluconazol ou o itraconazol podem inibir as enzimas do citocromo P450, especialmente o cype 26, que controla a concentração de ácido retinóico nas células humanas, o antifúngico pode aumentar o efeito da isotretinoína e as concentrações nos tecidos-alvo. o fluconazol demonstrou ser um potente inibidor do citocromo P45032 Segurança da isotretinoína em aerossol . Como o uso de isotretinoína está aumentando, é importante que os médicos estejam cientes dos eventos adversos, toxicidades e problemas de manejo relacionados ao seu uso. A questão mais importante é a de defeitos congênitos, que resultou em novas políticas e programas de prevenção de gravidez implementados pelo fabricante. Uma preocupação relativamente nova é a da depressão associada ao uso de isotretinoína, resultando também em novas políticas colocadas pelo fabricante e pelo FDA. O estudo deve ser um pequeno estudo piloto investigando se há algum sinal de eficácia que justifique um ensaio maior de Fase 2B ou qualquer dano que sugira que tal ensaio não deva ser feito. O investigador examinará todos os dados biológicos, fisiológicos e clínicos para determinar se um estudo de Fase 2B é justificado. E ele também deve obedecer a estas regras: A isotretinoína deve ser administrada na forma de aerossol por via respiratória completa para que tenha um efeito focado apenas nas células pulmonares para não afetar nenhum outro órgão. A inalação de aerossol pode depositar a droga diretamente na população de células capturadas na fase inicial do câncer, potencialmente alcançando muito mais eficiência em comparação com a dependência da difusão do sangue. A aplicação direta de ácido retinóico em aerossol no epitélio pulmonar pode evitar grande parte da ligação de proteínas e efeitos colaterais graves em outros órgãos, especialmente órgãos congênitos, aumentando assim muito a potência no local-alvo.35 Porque um estudo em coelhos demonstrou que a isotretinoína pode ser administrada na forma de aerossol sem efeitos colaterais graves. Doses altas repetidas de 13 cis retinóico por inalação resultaram em perda moderada de peso corporal, mas a investigação microscópica de dez tecidos por inalação sem qualquer dano no pulmão, incluindo pulmão e esôfago, não detectou nenhum dano significativo induzido por aerossol, portanto, a isotretinoína inalada pode fornecer medicamento suficiente às células-alvo no pulmão para eficácia, evitando toxicidade sistêmica © 2000 Cancer Research Campaign33 Em 2006, um ensaio clínico conduzido para avaliar a viabilidade de retinóides para o tratamento de enfisema, o estudo FORTE, foi publicado (NCT00000621)33. Nesse estudo, 148 pacientes de cinco hospitais universitários foram recrutados e randomizados para receber ATRA em dose baixa (1 mg/kg/dia por 4 dias/semana) ou dose alta (2 mg/kg/dia por 4 dias/semana) , ácido 13-cis retinóico (1 mg/kg/dia, diariamente) ou placebo por 6 meses, seguido por uma fase cruzada de 3 meses. Posteriormente, eles foram observados por mais 9 meses antes da avaliação final. No estudo, os retinóides (ácido 13 cis-retinóico) provaram ser seguros, pois os EAs relacionados ao medicamento foram geralmente leves.37 Além disso, a isotretinoína em aerossol deve ser administrada em dose baixa de acordo com o peso do paciente e também deve ser administrada gradualmente em concentração por um curto período não superior a 14 dias a partir da data de administração da primeira dose Em contraste com o longo curso de tratamento, que é considerado tratamento crônico e o ácido 13 cis retinóico em aerossol deve ser administrado gradualmente em uma dose diária aumentada de 0,2 mg/kg/dia para 2 mg/kg/dia por via inalatória terapia com ácido 13 cis retinóico por 14 dias Um estudo demonstrou que a aplicação do sistema de ácido retinóico em aerossol levou a um aumento dos níveis de ácido retinóico no pulmão, mas não no fígado ou no plasma. Os níveis pulmonares celulares de retinol, palmitato de retinil e estearato de retinil também pareceram não afetados (245,6 ± 10,7, 47,4 ± 3,4 e 132,8 ± 7,7 ng•g-1 de peso úmido, respectivamente). E também demonstrou que a aplicação deste Ácido Retinóico em aerossol também induziu uma expressão proteica dose-dependente da proteína celular de ligação ao retinol 1 (CRBP-1) no pulmão, sem efeitos colaterais nocivos aparentes.38 Embora mais de um estudo clínico tenha relatado segurança e efeitos colaterais não graves da isotretinona sistêmica, recomendamos fortemente que a isotretinoína seja administrada na forma de aerossol com curto período de tratamento e com baixa dose gradual para atingir as células pulmonares apenas para evitar qualquer potencial efeitos colaterais. Um estudo clínico aplicado em 1.166 pacientes através de um estudo de fase III (NCI #I91-0001) em um National Cancer Institute (NCI) demonstrou que após o acompanhamento médio de 3,5 anos, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os braços placebo e isotretinoína com relação ao tempo para SPTs, recorrências ou mortalidade. Neste estudo, os pacientes foram aleatoriamente designados para receber um placebo ou o retinóide isotretinoína (30 mg/dia) por 3 anos de forma duplo-cega. Os pacientes foram estratificados na randomização por estágio do tumor, histologia e tabagismo. O endpoint primário (tempo para SPT) e os endpoints secundários (tempos para recorrência e morte) foram analisados ​​pelo teste de log-rank e o modelo de riscos proporcionais de Cox. Todos os testes estatísticos foram bilaterais.34 Um estudo realizado em 720 pacientes que receberam um ou mais ciclos de tratamento com isotretinoína oral e tiveram um período médio de acompanhamento de 4,9 anos (intervalo de 2/12 anos). A maioria dos pacientes (442) recebeu uma dose cumulativa total de 120/200 mg/kg de peso corporal. Cento e sessenta e dois pacientes receberam uma dose cumulativa de

Segurança do fluconazol em aerossol

Um estudo demonstrou que o fluconazol pode ser administrado por via inalatória. A terapia de doenças fúngicas respiratórias ainda enfrenta desafios como resultado do aumento de doenças autoimunes, cânceres e uso de medicamentos imunossupressores. O fluconazol é um agente antifúngico de amplo espectro e ainda é usado com sucesso no tratamento de infecções oportunistas em combinação com outros agentes antifúngicos. Visto que, o tratamento de doenças fúngicas respiratórias requer hospitalização prolongada; pode aumentar as chances de outras infecções oportunistas. Considerando a resistência relatada aos medicamentos e os efeitos adversos da administração sistêmica, parece que a terapia antifúngica pulmonar localizada pode ser uma via alternativa adequada. De acordo com as propriedades de inalação adequadas relatadas de pós secos por pulverização; técnica de secagem por pulverização foi usada para preparar pós de fluconazol.39