Эффективность и безопасность комбинированной терапии изотретиноином и некоторыми противогрибковыми препаратами в качестве потенциальной аэрозольной терапии COVID-19: инновационный терапевтический подход к COVID-19 (Isotretinoin)

Это небольшое пилотное исследование, в котором изучается, есть ли какие-либо признаки эффективности комбинированной терапии изотретиноином и некоторыми противогрибковыми препаратами при лечении COVID-19, которые требуют более крупного исследования фазы III, или какой-либо вред, который предполагает, что такое испытание не следует проводить. Ожидается, что он даст статистически значимые результаты по основным конечным точкам. Исследователь изучит все биологические, физиологические и клинические данные, чтобы определить, оправдано ли исследование фазы III.

Первичный анализ эффективности будет проводиться только у пациентов, получивших не менее 4 доз активного комбинированного препарата. Анализ безопасности будет проводиться для всех пациентов, получающих хотя бы одну дозу активного препарата.

введение

В Ухане, провинция Хубэй, Китай, случаи острой респираторной инфекции были зарегистрированы в декабре 2019 г.1,2 Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) первоначально сообщил, что причиной этого заболевания является коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), а затем установлено, что это новый коронавирус. Это заболевание, обозначенное ВОЗ как коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19), быстро распространяется на другие города Китая и стало чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение (PHEIC) после его глобального распространения. Клиническими проявлениями COVID-19 являются лихорадка, кашель, мышечная боль, утомляемость, диарея и пневмония, которые в тяжелых случаях могут привести к смерти.4Китай сообщил о 72436 случаях подтвержденного COVID-19 и 1868 летальных исходах до 18 февраля 2020 г.5 Врожденная иммунная система представляет собой первую линию защиты и инициирует противодействующие реакции, которые защищают хозяина от вирусной инфекции посредством эволюционно законсервированных рецепторов распознавания образов (PRR) 6. PRR включают мембраносвязанные Toll-подобные рецепторы (TLR) и цитозольные сенсоры, такие как как индуцируемые ретиноевой кислотой ген-I (RIG-I)-подобные рецепторы (RLR), которые обнаруживают РНК-вирусы 6. RIG-I специфически обнаруживает внутриклеточную двухцепочечную вирусную РНК, несущую 5'-трифосфатные и ручкообразные структуры, для активации противовирусной передачи сигналов7,8. После того, как хозяин заражен вирусом, PRR передают сигналы нижестоящим киназам, которые активируют факторы транскрипции, включая регуляторный фактор IFN-3 (IRF3), ядерный фактор κB (NF-κB) и ATF-2/c-jun, с помощью различных адаптерных молекул (MAVS/IPS-1/VISA/Cardif для RIG-I, TRIF для TLR3 и MyD88 для TLR7/8/9) для активации продукции IFN9,10,11. или инактивировать врожденный иммунный сигнальный путь для их репликации. 12. Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) — это высококонтагиозное респираторное заболевание, которое впервые появилось в Китае в 2002 г. и заразило более 8000 человек во всем мире и привело к гибели около 800 инфицированных. Коронавирус SARS (SARS-CoV) имеет одноцепочечный геном с положительной смысловой РНК размером приблизительно 29,7 т.п.н. 13,14. Многочисленные исследования показали, что SARS-CoV развивает антагонистический механизм, позволяющий избежать противовирусной активности IFN-15. посредники, как сообщается, притуплены; Предыдущие исследования показали, что папаин-подобная протеаза (PLpro) SARS-CoV ингибирует активацию пути IRF3, который обычно вызывает сильный ответ IFN, но механизм(ы), используемый SARS PLpro для ингибирования активации пути IRF3, не полностью изучен. известно.16 Являясь ключевыми компонентами немедленного противовирусного ответа, интерфероны типа I имеют решающее значение для ограничения репликации и распространения вируса посредством передачи сигналов аутокринного и паракринного рецептора IFN I типа (IFNAR). Интерфероны типа 1 обладают широкой противовирусной активностью in vitro и в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях для лечения БВРС-КоВ. Однако минимальные количества ИФН были обнаружены в периферической крови или легких пациентов с тяжелой формой COVID-19 мышиной модели инфекции SARS-CoV локальные ответы IFN в легких были отсрочены по сравнению с пиковой репликацией вируса, что препятствовало элиминации вируса и было связано с развитием CRS19. SARS-CoV-2 ORF3b является мощным ингибитором и антагонистом интерферона 20. Нарушение регуляции ответов IFN свидетельствует об эффективных иммуномодулирующих стратегиях, используемых бета-коронавирусами. Во время фазы инкубации SARS-CoV-2 скрытно реплицируется в клетках-хозяевах без заметной активации интерферонов, что приводит к высокой вирусной нагрузке1. Известно, что коронавирусы индуцируют образование мембранных компартментов, предназначенных для синтеза вирусной РНК, и тем самым скрывают молекулярные паттерны вирусных патогенов (PAMP; например, вирусные РНК) от обнаружения рецепторами распознавания паттернов хозяина (PRR), такими как RIG-I и МДА5. Кроме того, известно, что некоторые консервативные белки бета-коронавируса, преимущественно неструктурные белки (nsps), проявляют прямую антагонистическую активность в отношении IFN. Некоторые модифицируют специфические свойства вирусной РНК (путем катализа метилирования гуанозина-N7 и рибозы-2'-O), чтобы избежать распознавания специфическими PRR (например, nsp14 и nsp16), в то время как другие, такие как nsp3 и nsp1, ингибируют сигнал. трансдукция, опосредованная PRR и IFNAR соответственно19

--Влияние TLR3 на IFN типа I

Толл-подобные рецепторы (TLR) представляют собой класс рецепторов распознавания образов (PRR), которые инициируют врожденный иммунный ответ на вторгшиеся патогены, обнаруживая консервативные молекулярные паттерны для раннего иммунного распознавания патогенов, таких как вирусы, бактерии и грибы, чтобы инициировать врожденный иммунный ответ на вторгшиеся патогены. проникновение возбудителей. Кроме того, TLR играют важную роль в восстановлении тканей и воспалении, вызванном повреждением тканей. Появление высокопатогенных коронавирусов тяжелого острого респираторного синдрома (MERSCoV) вызывает озабоченность у глобального общественного здравоохранения, поскольку отсутствуют эффективные вакцинные платформы и стратегии противовирусной терапии21. Исследование показало, что предварительная стимуляция TLR3 полиинозинполицитидиловой кислоты (поли I:C) препятствует инфицированию MHV посредством индукции INF-β в макрофагах. 22 Исследование показало, что TLR3(-/-), TLR4(-/-) Мыши TRAM(-/-) более восприимчивы к SARS-CoV, чем мыши дикого типа, но испытывают только временную потерю веса без смертности в ответ на инфекцию. Напротив, мыши с дефицитом адаптера TLR3/TLR4 TRIF очень восприимчивы к инфекции SARS-CoV, демонстрируя повышенную потерю веса, смертность, снижение функции легких, усиление патологии легких и более высокие титры вируса. Чен показал высокий уровень IFN-α/β, продуцируемый путем TLR3-IRF3/IRF7, и IFN-β является причиной ингибирования репликации DENV. В клетках HUH-7 huTLR3 может распознавать DENV-1 и индуцировать экспрессию IFN-β, что, наоборот, может усиливать экспрессию huTLR3. TLR3 также индуцирует интерферон I типа во время ВЗН..21

--Влияние изотретиноина 13 цис-ретиноевой кислоты на TLR3 и TLR-2

Известно, что многие из генов со значительной активацией являются генами, чувствительными к ретиноидам, включая: ген, отвечающий на ретиноевую кислоту 1 [тазаротен-индуцируемый ген 1 (TIG1)}, клеточный ретинол-связывающий белок 1 и клеточный ретинол-связывающий белок 2. Кроме того, кальций- связывающие белки (т.е. белки S100), сериновые протеазы, ингибиторы сериновых протеаз (серпины), липокалин и растворенные носители были значительно затронуты 13-цис RA25. Кроме того, анализ экспрессии генов в себоцитах SEB-1 и кератиноцитах HaCaT при 72-часовой обработке 13-цис RA Выявлено, что произошли изменения в нескольких генах, участвующих в апоптозе и врожденном иммунитете, таких как TNFα-индуцированный белок 2, TRAIL, интерферон-регуляторный фактор 1 (IRF1), интерферон-индуцированные белки, NFκB, рецептор смерти, Fas и TIG3 (он же индуцируемый ретиноевой кислотой ген 1 (RIG1)). TIG3 кодирует РНК-хеликазу и представляет собой ключевой внутриклеточный белок, который, как и TLR3, может распознавать вирусную двухцепочечную РНК (дцРНК). 26 изотретиноин может ингибировать цитокиновый шторм Тщательное изучение TLR-2 показало, что лечение пациентов изотретиноином значительно снижало экспрессию моноцитов TLR-2 и последующий воспалительный цитокиновый ответ на P. acnes после 1 недели терапии. Этот эффект сохранялся в течение 6 месяцев после прекращения терапии, что указывает на то, что модуляция TLR-2 может быть вовлечена в устойчивый терапевтический ответ на изотретиноин.22 Напротив, 13-цис-ретиноевая кислота индуцировала значительную активацию экспрессии толл-подобного рецептора 3 (TLR3), митохондриального противовирусного сигнального белка (MAVS) и индуцированного ретиноидами гена I (RIG-I) и регуляторного фактора 1 IFN в зависимости от времени. 23 это может привести к иммунному ответу на интермедиат дцРНК, который может частично генерироваться во время репликации CoV-2. TLR3, сенсибилизированный дцРНК, и каскады сигнальных путей (активация IRF и NFκB соответственно) активируются с образованием интерферонов I типа. Производство IFN типа I важно для усиления высвобождения антивирусных белков для защиты неинфицированных клеток. Иногда дополнительные белки CoV могут мешать передаче сигналов TLR3 и связывать дцРНК CoV во время репликации, чтобы предотвратить активацию TLR3 и уклониться от иммунного ответа. Регуляторный фактор интерферона 1 (IRF1) был идентифицирован как критический фактор, опосредующий индукцию TRAIL ретиноевой кислотой в клетках лейкемии NB4 APL и клетках рака молочной железы SK-BR-3. Интересно, что 13-цис-RA значительно повышает экспрессию гена IRF1 (увеличение в 2,42 раза) в себоцитах SEB-1 27

Влияние противогрибковых препаратов на индукцию эффекта изотретиноина и его концентрацию в тканях-мишенях

Итраконазол и флуконазол представляют собой противогрибковые препараты с триазольным азольным кольцом, представляющие собой многокольцевые синтетические соединения, содержащие три атома азота. лекарственные средства нацелены на увеличение концентрации ретиноидов в клетках-мишенях31 Ингибиторы CYP26 Увеличивают передачу сигналов ретиноидов в клетках гладкой мускулатуры интимы32 Итраконазол обладает меньшими ингибирующими свойствами, чем имидазолы в микросомах печени крысы29. ICZ препятствует пути синтеза эргостерола в клетке-хозяине и ингибирует ферменты цитохрома P450, особенно фермент cyp 34, который метаболизирует ретиноевую кислоту в клетках человека, что увеличивает концентрацию ретиноевой кислоты в клетках-мишенях млекопитающих40, что приводит к активации TOLL-подобных рецепторов, индуцирующих его противовирусный механизм. индуцировать уровни экспрессии IFN типа I в направлении индукции преактивированного состояния, тем самым ускоряя индуцированный вирусом ответ клеток-хозяев41. IFN могут служить первой линией иммунной защиты от вирусных инфекций.41 ИФН являются очень мощными цитокинами, которые играют ключевую роль в борьбе с патогенными инфекциями, контролируя воспаление и иммунный ответ, непосредственно индуцируя молекулярные контрмеры против патогенов. три класса интерферонов: тип I, тип II и тип III. Несмотря на то, что было показано, что флуконазол является мощным ингибитором цитохрома Р450 30 Здесь мы предполагаем, что это противогрибковый препарат. Флуконазол или итраконазол могут ингибировать ферменты цитохрома P450, особенно cype 26, которые контролируют концентрацию ретиноевой кислоты в клетках человека. Противогрибковые средства могут усиливать как эффект изотретиноина, так и концентрацию в тканях-мишенях. Было показано, что флуконазол является мощным ингибитором цитохрома Р45032. Безопасность аэрозольного изотретиноина Изотретиноин (аккутан, Roche Laboratories Inc, Nutley, NJ) является важным лекарственным средством не только для лечения тяжелых форм акне, но также для других диагнозов и в условиях химиопрофилактики. . Поскольку использование изотретиноина увеличивается, врачам важно знать о побочных эффектах, токсичности и проблемах лечения, связанных с его использованием. Наиболее важной проблемой являются врожденные дефекты, что привело к внедрению новой политики и программ предотвращения беременности производителем. Относительно новой проблемой является депрессия, связанная с использованием изотретиноина, что также приводит к новой политике, установленной производителем и FDA. исследование должно быть небольшим пилотным исследованием, направленным на изучение того, есть ли какие-либо признаки эффективности, которые оправдывают проведение более крупного исследования фазы 2B, или какой-либо вред, который свидетельствует о том, что такое исследование не следует проводить. Исследователь изучит все биологические, физиологические и клинические данные, чтобы определить, оправдано ли исследование фазы 2B. И он также должен соблюдать эти правила: Изотретиноин необходимо вводить в виде аэрозоля через дыхательные пути, чтобы он оказывал действие, направленное только на клетки легких, чтобы не воздействовать на какие-либо другие органы. Вдыхание аэрозоля может наносить лекарство непосредственно на популяцию клеток, захваченных на ранней стадии рака, потенциально достигая гораздо большей эффективности по сравнению с диффузией из крови. Прямое нанесение ретиноевой кислоты в виде аэрозоля на эпителий легкого может избежать большей части связывания с белком и серьезных побочных эффектов на другие органы, особенно на врожденные органы, что значительно увеличивает эффективность в целевом участке. Потому что исследование на кроликах показало, что изотретиноин можно давать в виде аэрозоля без серьезных побочных эффектов. Многократное введение высоких доз 13-цис-ретиноевой кислоты путем ингаляции привело к умеренной потере массы тела, но микроскопическое исследование ингаляционного пути десяти тканей без какого-либо повреждения легких, включая легкие и пищевод, не выявило каких-либо значительных повреждений, вызванных аэрозолем, поэтому ингаляционный изотретиноин может обеспечить достаточное количество лекарственного средства. к клеткам-мишеням в легких для эффективности при избежании системной токсичности. В этом исследовании 148 пациентов из пяти университетских больниц были отобраны и рандомизированы для получения ATRA либо в низкой дозе (1 мг/кг/день в течение 4 дней в неделю), либо в высокой дозе (2 мг/кг/день в течение 4 дней в неделю). , 13-цис-ретиноевая кислота (1 мг/кг/день, ежедневно) или плацебо в течение 6 месяцев с последующей 3-месячной перекрестной фазой. Впоследствии они наблюдались еще в течение 9 месяцев до окончательной оценки. В ходе испытаний было доказано, что ретиноиды (13-цис-ретиноевая кислота) безопасны, поскольку НЯ, связанные с приемом лекарств, обычно были легкими.37 Кроме того, аэрозольный изотретиноин следует вводить в низкой дозе в соответствии с массой тела пациента, а также постепенно вводить концентрацию в течение короткого периода, не превышающего 14 дней с даты введения первой дозы. В отличие от длительного курса лечения, который считается хроническим лечением, и аэрозольный раствор 13-цис-ретиноевой кислоты следует вводить постепенно, один раз в день. Аэрозольная система ретиноевой кислоты приводила к повышению уровня ретиноевой кислоты в легких, но не в печени или плазме. Клеточные уровни ретинола, ретинилпальмитата и ретинилстеарата в легких также не изменились (245,6 ± 10,7, 47,4 ± 3,4 и 132,8 ± 7,7 нг•г-1 сырого веса соответственно). А также продемонстрировано, что применение этой аэрозольной ретиноевой кислоты также индуцирует дозозависимую экспрессию клеточного ретинол-связывающего белка 1 (CRBP-1) в легких без явных вредных побочных эффектов.38 Хотя в более чем одном клиническом исследовании сообщалось о безопасности и несерьезных побочных эффектах системного изотретинона, мы настоятельно рекомендуем, чтобы изотретиноин вводился в форме аэрозоля с коротким периодом лечения и с низкой постепенной дозой на клетки-мишени легких только для избежания любого потенциального побочные эффекты. Клиническое исследование, проведенное на 1166 пациентах в рамках тщательного исследования фазы III (NCI #I91-0001) в Национальном институте рака (NCI), показало, что после медианы наблюдения в 3,5 года не было статистически значимых различий между группами плацебо и изотретиноина. в отношении времени до КПТ, рецидивов или смертности. В этом исследовании пациентов рандомизировали для получения плацебо или ретиноида изотретиноина (30 мг/день) в течение 3 лет двойным слепым методом. Пациенты были стратифицированы при рандомизации по стадии опухоли, гистологии и статусу курения. Первичную конечную точку (время до КПТ) и вторичные конечные точки (время до рецидива и смерти) анализировали с помощью логарифмического рангового критерия и модели пропорциональных рисков Кокса. Все статистические тесты были двусторонними.34 Исследование, проведенное на 720 пациентах, получивших один или несколько курсов перорального лечения изотретиноином, со средним периодом наблюдения 4,9 года (диапазон 2/12 лет). Большинство пациентов (442) получили общую кумулятивную дозу 120/200 мг/кг массы тела. Сто шестьдесят два пациента получили кумулятивную дозу

Безопасность аэрозольного флуконазола

Исследование показало, что флуконазол можно вводить ингаляционным путем. Терапия респираторных грибковых заболеваний по-прежнему сталкивается с проблемами в результате роста аутоиммунных заболеваний, рака и использования иммунодепрессантов. Флуконазол является противогрибковым средством широкого спектра действия и до сих пор успешно используется при лечении оппортунистических инфекций в сочетании с другими противогрибковыми средствами. Так как лечение грибковых заболеваний органов дыхания требует длительной госпитализации; это может увеличить шансы других оппортунистических инфекций. Принимая во внимание сообщения о лекарственной устойчивости и побочных эффектах системного введения, кажется, что локальная легочная противогрибковая терапия может быть подходящим альтернативным путем. Согласно сообщениям о подходящих ингаляционных свойствах порошков, высушенных распылением; Для приготовления порошков флуконазола использовали метод распылительной сушки.39