Powtórzenie nakłucia lędźwiowego po 24 i 48 godzinach od urazowego nakłucia lędźwiowego u noworodków

PROJEKT BADANIA Otwarta, randomizowana próba kontrolna, z warstwowaniem i blokowaniem. MIEJSCE STUDIÓW Oddział Noworodkowy i Oddział Ratunkowy Noworodka Podyplomowego Instytutu Kształcenia i Badań Medycznych (PGIMER).

Ten pierwszy to oddział intensywnej terapii noworodków (NICU) poziomu 3. OKRES STUDIÓW Wymienione gdzie indziej KRYTERIA KWALIFIKACYJNE Wymienione gdzie indziej ZGODA Dostarczono kartę informacyjną dla rodziców. Świadomą pisemną zgodę uzyskano od rodziców pacjenta, po czym osoby zostały włączone do badania. Zgoda zawierała informację o zabiegu i badaniu z nim związanym. Uwzględniono również czynniki ryzyka związane z zabiegiem i po zabiegu. Wszystkie osoby zostały włączone po uzyskaniu dobrowolnej zgody odpowiednich rodziców.

PROCEDURA Po włączeniu wykonano nieskorygowane białe krwinki (WBC), skorygowaną liczbę białych krwinek, liczbę krwinek czerwonych (RBC), stężenie glukozy, stężenie białka, stężenie prokalcytoniny w płynie mózgowo-rdzeniowym, barwienie metodą Grama oraz hodowlę i czułość mikroorganizmów.

Po LP pacjent został losowo przydzielony i powtórzono LP albo po 24 godzinach, albo po 48 godzinach i zbadano nieskorygowaną WBC, skorygowaną liczbę WBC, liczbę RBC, stężenie glukozy, stężenie białka, barwienie metodą Grama oraz hodowlę i wrażliwość mikroorganizmów.

PARAMETRY PODSTAWOWE Ciąża, Masa urodzeniowa, Płeć, Wiek poporodowy, Aktualna waga, Wskazania do wstępnego nakłucia lędźwiowego u noworodka, Staż pracy osoby wykonującej wstępne nakłucie lędźwiowe, Liczba płytek krwi, jeśli jest dostępna przed wstępnym nakłuciem lędźwiowym, Raport z badania układu krzepnięcia, jeśli dostępne, przed pierwszym nakłuciem lędźwiowym i powtórnym nakłuciem lędźwiowym, Glukoza we krwi pełnej mierzona glukometrem przed pierwszym LP.

Parametry mierzone podczas wstępnego nakłucia lędźwiowego

o Nieskorygowana i skorygowana liczba WBC: Komórki zliczono przy użyciu dwóch metod. Jeden znajdował się w komorze Neubauera w ciągu 30 minut od wykonania LP. 60 μl płynu mózgowo-rdzeniowego rozdzielono do 2 probówek Eppendorfa, oznaczonych A i B. 27 μl płynu mózgowo-rdzeniowego w pierwszej probówce Eppendorfa, tj. oznaczonej A, rozcieńczono błękitem metylenowym przy użyciu standardowych mikropipet laboratoryjnych i użyto do napełnienia komory. Liczbę komórek zarówno WBC, jak i RBC wykonano jako standardową procedurę.

Kolejne 27 μl płynu mózgowo-rdzeniowego z probówki Eppendorfa oznaczonej B rozcieńczono stosując 3 μl płynu Turka zawierającego fiolet goryczkowy i octan lodowaty. Płyn Turka zasadniczo powoduje lizę krwinek czerwonych. Następnie ładuje się jedną stronę komory i oblicza WBC w jasnoszarych kwadratach (n). Liczba białych krwinek na mikrolitr = n x 25/9. W celu zliczenia RBC - 3 μl błękitu metylenowego dodano do 27 μl płynu mózgowo-rdzeniowego, aby uzyskać 30 μl. Naładowano jedną stronę komory i policzono RBC na ciemnoszarych kwadratach (n). Całkowita liczba krwinek czerwonych zliczona na mikrolitr = n x 500/9. Jak wspomniano, WBC i RBC zliczano również w automatach dostępnych w głównym laboratorium hematologicznym oraz w laboratorium ratunkowym. W pełni zautomatyzowanym analizatorem maszyny jest Sysmex XN-1000 (Sysmex-Kobe, Japonia). Analizator serii XN posiada tryb badawczy, który wykorzystuje fluorescencyjną cytometrię przepływową i pomiary impedancji do zliczania liczby białych krwinek i czerwonych krwinek w płynie mózgowo-rdzeniowym. Do pomiaru krwinek czerwonych zastosowano zarówno techniki optyczne (dla niższych zakresów stężeń), jak i impedancyjne (dla wyższych stężeń). W kanale różnicowej fluorescencji WBC całkowite i różnicowe zliczenia WBC są oparte na pomiarach cytometrii przepływowej (np. rozproszenie boczne, rozproszenie do przodu i fluorescencja DNA/RNA). Przed analizą w trybie badawczym XN hsA próbka nie wymagała żadnego przygotowania.

Stężenie glukozy- Stężenie glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym oszacowano metodą kolorymetryczną po utlenieniu enzymatycznym w obecności oksydazy glukozowej, ale bez rozkładu białka. Powstający podczas reakcji nadtlenek wodoru reaguje z fenolem i 4-aminofenazonem, tworząc czerwono-fioletowy barwnik chinonoiminowy, który pełni rolę wskaźnika. Intensywność wytwarzanego koloru jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy i jest mierzona przy długości fali 505 nm. Model maszyny to Adiva 1800 firmy Siemens.

Stężenie białka- Jest to również oznaczenie ilościowe za pomocą fotometrycznego testu barwnego wykonywanego w analizatorze Beckman Coulter. Czerwień pirogalolowa łączy się z molibdenianem, tworząc czerwony kompleks o maksymalnej absorpcji przy długości fali 470 nm. Test opiera się na absorpcji przesunięcia, która zachodzi, gdy kompleks czerwieni pirogalolu i molibdenianu wiąże zasadowe grupy aminokwasów w cząsteczkach białka. Powstaje niebiesko-fioletowy kompleks o maksymalnej absorbancji przy długości fali 600 nm. Absorbancja tego kompleksu jest wprost proporcjonalna do stężenia białka w próbce.

Stężenie prokalcytoniny — prokalcytoninę w płynie mózgowo-rdzeniowym określono za pomocą dwuetapowego testu immunologicznego z elektrochemiluminescencją kanapkową z użyciem znakowanego biotyną swoistego przeciwciała prokalcytoniny i monoklonalnego przeciwciała swoistego dla prokalcytoniny znakowanego kompleksem rutenu (Roche Diagnostics, Niemcy). 200 µl próbki płynu mózgowo-rdzeniowego inkubowano w 37 stopniach C z przeciwciałami przeciwko prokalcytoninie znakowanymi biotyną i rutenem. W drugiej inkubacji dodano antymikrocząstki powlekane streptawidyną, które wiążą kompleks poprzez interakcję biotyna-streptawidyna. Mieszanina reakcyjna jest zasysana do celi pomiarowej, w której mikrocząstki są magnetycznie wychwytywane na powierzchni elektrody. Niezwiązane substancje są usuwane przez przemywanie, a po przyłożeniu napięcia do elektrody indukowana jest chemiluminescencja, którą mierzy się fotopowielaczem. Zakres pomiarowy testu to 2 ng/dl - 10000 ng/dl przy czułości funkcjonalnej 6 ng/dl i czułości analitycznej 2 ng/dl.

Barwienie metodą Grama urazowego nakłucia lędźwiowego Kultura i czułość urazowego nakłucia lędźwiowego Zgodnie z polityką jednostki, liczbę komórek płynu mózgowo-rdzeniowego wykonano w ciągu 30 minut od LP pod mikroskopem w laboratorium na OIOM-ie dla noworodków przez personel przeszkolony w zakresie liczby komórek płynu mózgowo-rdzeniowego. Zrobiono to, aby uniknąć degeneracji WBC i RBC oraz spadku liczby WBC z powodu opóźnienia w analizie.

SEKWENCJA RANDOMIZACJI Kwalifikujący się pacjenci zostali zapisani w ciągu mniej niż 24 godzin po początkowym LP. Sekwencja randomizacji bloków została wygenerowana ze strony internetowej www.randomization.com. W tym badaniu zastosowano permutowane, parzyste, losowo zmieniające się rozmiary bloków ze stosunkiem alokacji 1: 1.

ZATWIERDZENIE KOMITETU ETYCZNEGO Badanie zostało zatwierdzone przez The Institutional Ethics Committee of PGIMER, Chandigarh (INT/IEC/2019/000557) WYKLUCZENIA PO RANDOMIZACJI Wspomniane gdzie indziej UKRYWANIE PRZYDZIAŁU Kolejność losowego przydziału była ukryta za pomocą kolejno ponumerowanych, nieprzezroczystych zapieczętowanych kopert, które zawierały odcinki artykuł, w którym wspomniano o grupie randomizacji. Po rejestracji na kopercie wpisano nazwisko pacjenta. Dopiero po wpisaniu imienia i nazwiska koperta została rozerwana, a następnie realizowana była przydzielona interwencja wewnątrz koperty.

GRUPY INTERWENCYJNE Badani zostali losowo przydzieleni do 2 grup. Jedna grupa składała się z pacjentów, u których powtórzono LP 24 godziny po początkowym traumatycznym LP. Druga grupa składała się z pacjentów, u których powtórzono LP po 48 godzinach od pierwotnego traumatycznego LP.

Oślepienie Lekarzy i pielęgniarek pracujących na OIOM-ie dla noworodków nie było możliwe. Jednak personel laboratoriów mikrobiologicznych, hematologicznych i biochemicznych nie znał grupy przydziału.

WYNIKI MIERZONE W POWTÓRNYM LP:

Poziom glukozy we krwi przed wykonaniem LP, Niezależnie od tego, czy pobrano próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego, próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego: czy to czysta krew, wyraźnie zabarwiona krwią, mikrourazowa lub nieurazowa, liczba krwinek czerwonych w płynie mózgowo-rdzeniowym, liczba białych krwinek w płynie mózgowo-rdzeniowym (nieskorygowana i skorygowana), glukoza w płynie mózgowo-rdzeniowym, białko płynu mózgowo-rdzeniowego, płyn mózgowo-rdzeniowy Barwienie metodą Grama, kultura i czułość. Podobnie jak w przypadku pierwszego LP, liczbę komórek płynu mózgowo-rdzeniowego wykonano w ciągu 30 minut od wystąpienia LP pod mikroskopem w laboratorium po stronie OIOM-u przez personel przeszkolony w zakresie liczenia komórek płynu mózgowo-rdzeniowego.

STANDARD REFERENCYJNY Pewne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych Dodatni posiew płynu mózgowo-rdzeniowego i/lub barwienie metodą Grama Prawdopodobne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych Dodatni prokalcytonina (PCT) płynu mózgowo-rdzeniowego. Aby określić dodatni PCT w płynie mózgowo-rdzeniowym, przyjęliśmy wartość odcięcia wynoszącą 33 ng/dl lub więcej. Zostało to oparte na badaniu Reshi i wsp. (18). Badanie przeprowadzono na oddziale intensywnej terapii noworodków Oddziału Neonatologii i Pediatrii w SKIMS w Srinagar przez okres 2 lat (od stycznia 2014 r. do grudnia 2015 r.). Badanie było badaniem prospektywnym, które obejmowało niemowlęta w wieku 28 dni, które zakwalifikowały LP jako część leczenia sepsy. Zdefiniowali traumatyczne nakłucie lędźwiowe jako próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego zawierającą ⩾500 krwinek czerwonych/mm3, a liczbę leukocytów skorygowano przy średnim stosunku 500 krwinek czerwonych do 1 krwinek białych. Rozpoznanie bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych stawiano u noworodków z sepsą, u których stwierdzono dodatni wynik badania płynu mózgowo-rdzeniowego i/lub posiewu krwi lub dodatni wynik barwienia metodą Grama. Wykluczyli niemowlęta w wieku powyżej 28 dni lub noworodki, które otrzymały antybiotyki przed przyjęciem do szpitala, noworodki, które przeszły niedawną operację mózgu, jeśli oprócz zapalenia opon mózgowych lub wirusowego zapalenia opon mózgowych (wirus opryszczki pospolitej) obecne było inne ognisko infekcji. Kryteria po wykluczeniu Badanie zakończono na 168 noworodkach. Zaobserwowali, że przy wartości 0,33 ng/ml CSF PCT ma czułość 92%, swoistość 87%, dodatnią wartość predykcyjną (PPV) 85,2% i ujemną wartość predykcyjną (NPV) 93%. W naszym badaniu nie uwzględniliśmy innych konwencjonalnych parametrów CSF dla prawdopodobnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, takich jak CSF WBC, CSF CSF i CSF Protein dla definicji prawdopodobnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, ponieważ zamierzaliśmy zbadać te testy jako testy wskaźnikowe, a zatem nie mogły one również być częścią normy odniesienia.

PORÓWNANIE MIAR REZULTATÓW Wspomniano gdzie indziej