Wpływ owoców baobabu na glikemię poposiłkową u zdrowych osób dorosłych

Badanie to zostało zatwierdzone przez Wyższą Komisję ds. Etyki Egas Moniz Cooperativa de Ensino (kod protokołu 518) i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską (Deklaracja z 1975 r., poprawiona w 2000 r.). Świadoma zgoda została udzielona wszystkim kwalifikującym się uczestnikom, po ustnych i pisemnych informacjach o badaniu.

Ta randomizowana, kontrolowana próba kliniczna, ślepa na uczestników, została przeprowadzona z udziałem 31 osób rekrutowanych z Campus Universitário Egas Moniz w Monte de Caparica w Portugalii. Po spełnieniu kryteriów kwalifikowalności i podpisaniu świadomej zgody uczestnicy zostali poddani kryteriom włączenia i wyłączenia, a następnie losowo przydzieleni do grup kontrolnych lub interwencyjnych. Metoda kolejności przydziału została oparta na kolejnych numerach. Pierwszy pacjent został losowo przydzielony do grupy interwencyjnej lub kontrolnej, a kolejni pacjenci zostali kolejno przydzieleni na przemian do każdej grupy. Każdemu uczestnikowi nadano kodyfikację w celu zachowania anonimowości i zapewnienia poufności danych.

Po okresie 8-10 godzin na czczo grupie kontrolnej podano OGTT, a grupie interwencyjnej OGTT, a następnie wodny ekstrakt z baobabu.

Preparat z wodnym ekstraktem z baobabu:

Owoc baobabu został kupiony na targu Benfica, znajdującym się w mieście Luanda (Angola) i przywieziony do Lizbony (Portugalia) należycie zapakowany w plastikową torbę i przechowywany w wysuszonym środowisku lokalnym do czasu, gdy będzie potrzebny. Do wodnej ekstrakcji owoców odważono 40 ± 1 g miąższu, nasion i czerwonych włókien i owoce gotowano w 300 ml wody przez 5 minut. Po powolnym schłodzeniu do temperatury pokojowej ekstrakt umieszczono następnie w lodówce w pojemniku, gdzie pozostawał przez 8 godzin w średniej temperaturze 10°C. BAE przesiano za pomocą sita siatkowego, oddzielając je od nasion i włókien, a następnie poddano badaniu klinicznemu i testom przeciwutleniającym. W przypadku testów przeciwutleniających ekstrakt po filtracji przepuszczono przez blender (Kenwood Multipro Compact Food Processor FDP302SI), ponownie przesączono uzyskując jednorodne próbki, unikając tworzenia się osadów podczas analizy. Końcowe stężenie otrzymanego ekstraktu wodnego, zarówno do badania klinicznego, jak i analizy chemicznej, wynosiło 0,1333 g Adansonia digitata L. (AD)/ml świeżej masy ekstraktu (FW).

Interwencje:

Po całonocnym poście poziom glukozy we krwi oceniano za pomocą kropli krwi kapilarnej, bezpośrednio przed doustnym testem tolerancji glukozy (t0). Uczestnicy grupy kontrolnej spożywali sam roztwór glukozy (OGTT) przygotowany z 75 g bezwodnej doustnej glukozy zgodnie z zaleceniami American Dietetic Association (ADA), rozpuszczonej w 200 ml wody. Grupa interwencyjna spożywała roztwór glukozy, a następnie 250 ml wodnego ekstraktu z baobabu (33,33 g FW). Poziom glukozy we krwi mierzono również po 30 (t30), 60 (t60), 90 (t90) i 120 (t120) minutach bezpośrednio po interwencji, dla każdego uczestnika, w grupach kontrolnych i interwencyjnych. Do pomiaru stężenia glukozy we krwi wykorzystano sprzęt glukometryczny, paski do glukometrów (One Touch Select Plus) oraz sterylizowane nakłuwacze (Sarstedt normal 21G), z zachowaniem należytej dbałości o bezpieczeństwo i aseptykę. Na podstawie wartości glikemii, przy użyciu programu GraphPad Prism (wersja 5.0) zdefiniowano pole pod krzywą wzrostu glukozy we krwi (AUCi) każdego uczestnika. Maksymalne stężenia (Cmax) i zmiany maksymalnych stężeń (ΔCmax) określono przez porównanie ich z ich odpowiednimi wyjściowymi wartościami poziomów glikemii.

Ocena parametrów antropometrycznych:

Zbierano również parametry antropometryczne, a mianowicie wagę, wzrost i wskaźnik masy ciała (BMI). BMI obliczono jako wagę (kg) podzieloną przez wzrost (m2) do kwadratu (kg/m2). Masę ciała oszacowano na podstawie impedancji biologicznej za pomocą wagi Inbody®, model 230.

Ocena spożycia:

Uczestnicy badania wypełnili 24-godzinny kwestionariusz przypominający o żywności, który został dokładnie poinstruowany przez badacza, aby zidentyfikować całą spożytą żywność. Ilość każdego spożytego pokarmu została oszacowana za pomocą zdjęć. Wykorzystano książkę ze zdjęciami posiłków w różnych rozmiarach. Badacz przeglądał kwestionariusz razem z uczestnikiem. Spożycie pokarmu każdego uczestnika zostało przeanalizowane za pomocą oprogramowania The Food Processor SQL (wersja 11.3.285) uzyskanie energii całkowitej, węglowodanów, białek i lipidów oznacza spożycie.

Ocena zawartości fenolu całkowitego, proantocyjanidyn i garbników ulegających hydrolizie:

Całkowite stężenie fenoli oznaczono metodą Folina Ciocalteu, stosując jako wzorzec kwas galusowy. Wyniki wyrażono w mg równoważników kwasu galusowego/l (GAE/l). Do tej analizy 125 μl BAE, uprzednio rozcieńczonego (x15) w wodzie i 125 μl etanolu dodano do 2,5 ml roztworu odczynnika Folina-Ciocalteu (1:10 rozcieńczonego w H2O) i 2 ml wodnego roztworu węglanu sodu (Na2CO3) 1M. Po 15 minutach zmierzono absorbancję przy 765 nm.

Zawartość proantocyjanidyn oznaczono metodą Gu i wsp. (2002) z modyfikacjami, która polega na kwaśnej hydrolizie polimerów proantocyjanidyn wytwarzających czerwonawe pigmenty w gorącym roztworze 1-butanol/kwas solny. Dodano 200 μl rozcieńczonego (x2) BAE do 200 μl metanolu i 2600 μl 10% (obj./obj.) roztworu HCl/1-butanol. Probówki wytrząsano i inkubowano w temperaturze 100°C przez 50 minut. Absorbancję mierzono przy 550 nm. Wyniki wyrażono w mg równoważnikach proantocyjanidyn A2/L (EPA2/L).

Metodę Willisa i Allena zaadaptowano do oznaczania garbników ulegających hydrolizie BAE. Objętość 1 ml ekstraktu dodano do 5 ml 2,5% jodanu potasu (KIO3). Następnie mieszaninę mieszano i ponownie umieszczono w łaźni wodnej w temperaturze 25°C na 20 minut. Odczyt absorbancji przeprowadzono za pomocą spektrofotometru przy 550 nm, a wyniki wyrażono jako mg równoważników kwasu garbnikowego/l (TAE/l).

Testy przeciwutleniające:

Metoda zdolności przeciwutleniającej redukującej żelazo (FRAP): działanie przeciwutleniające (zdolność redukującą) oceniano poprzez monitorowanie powstawania intensywnego niebieskiego zabarwienia kompleksu Fe2+ TPTZ, zgodnie z testem przeciwutleniającej siły redukującej żelazo (FRAP). Objętość 2850µl (25ml 300mM roztwór buforu octanowego pH=3,6 plus 2,5ml 10mM roztwór TPTZ w HCl 40mM + 2,5ml 20mM FeCl3.6H2O roztwór) dodano do 150 µl rozcieńczonego BAE. Probówki trzymano w ciemności przez 30 minut (7 testów w różnych stężeniach). Absorbancję określono przy 593 nm, a wyniki wyrażono w mg równoważników Trolox/l (TE/l).

Metoda ABTS: ta metoda została oparta na zdolności próbki do hamowania rodnika ABTS (ABTS+) w porównaniu z referencyjnym standardem przeciwutleniacza (Trolox). Rodnik ABTS+ powstał w wyniku reakcji chemicznej z nadsiarczanem potasu (K2S2O8). Tak więc, 25 ml ABTS (7 mM) dodano do 440 µl K2S2O8 (140 mM) i pozostawiono w ciemności w temperaturze pokojowej na 12-16 godzin. Roztwór przygotowano, biorąc objętość poprzedniego roztworu i rozcieńczając go w etanolu, aż jego absorbancja przy λ = 734 nm wyniosła 0,70. Probówki trzymano w ciemności przez 30 minut. Wyniki wyrażono w mg ekwiwalentów Trolox/L (TE/L).

Metoda DPPH: ta metoda została określona przez zmiatacz rodników 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazylowy. Objętość 150 μl BAE dodano do 2850 μl roztworu DPPH przygotowanego wcześniej w metanolu o λ=515 nm 1,1. Roztwory trzymano przez 24 godziny bez dostępu światła. Absorbancję określono przy 515 nm, a wyniki wyrażono w mg równoważników Trolox/l (TE/l).

Zdolność hamowania anionu O2•- i rodnika NO:

Anion ponadtlenkowy jest generowany przez utlenianie NADH w reakcji z PMS i tlenem, powodując redukcję NBT. Objętość 500 μl BAE o różnym stężeniu dodano do 2 ml NADH (189 μM) i NBT (120 μM) w 40 mM buforze Tris-HCl pH 8. Reakcję rozpoczęto po dodaniu 0,5 ml PMS (60 µM) i po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zmierzono absorbancję przy 560 nm.

Test inhibicji rodników NO oparto na metodzie Nikkhah i współpracowników (2008). Objętość 250 μl BAE o różnych stężeniach dodano do 1 ml nitroprusydku sodu i 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Mieszaninę utrzymywano przez 150 minut w temperaturze 25°C. Następnie 0,5 ml tej mieszaniny dodano do 1 ml kwasu sulfanilowego (0,33% w 20% lodowatym kwasie octowym) i trzymano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 1 ml NED (0,1% wag./obj.) i tę mieszaninę utrzymywano przez 30 minut w temperaturze 25°C. Pod koniec reakcji utworzył się różowy chromofor. Absorbancję mierzono przy 540 nm. Procent hamowania rodników O2•- i NO określono za pomocą równania 1, a wyniki wyrażono w mg równoważników kwasu galusowego (GAE)/l.

Analiza statystyczna:

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Excel® i SPSS® (Statistical Package for Social Sciences) w wersji 27.0 dla komputerów Mac. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (odchylenie standardowe) i SEM (błąd standardowy średniej). ANOVA z powtarzanymi pomiarami typu mieszanego została wykorzystana do oceny różnicy między dwiema grupami pod względem stężenia glukozy we krwi po posiłku w różnym czasie. Test t dla niezależnych próbek wykorzystano do oceny różnic między dwiema grupami pod względem parametrów antropometrycznych, całkowitego spożycia energii, węglowodanów, białek i lipidów, wartości Cmax, ΔCmax i AUCi. Wszystkie testy statystyczne przeprowadzono na 5% poziomie istotności.