Efeito da fruta Baobá na glicemia pós-prandial em adultos saudáveis

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Egas Moniz Cooperativa de Ensino Superior (código de protocolo 518) e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque (Declaração de 1975, revisada em 2000). Um consentimento informado foi dado a todos os participantes elegíveis, após informações orais e escritas sobre o estudo.

Este ensaio clínico randomizado controlado, cego para sujeitos, foi realizado com 31 sujeitos, recrutados no Campus Universitário Egas Moniz, no Monte de Caparica, Portugal. Após a assinatura dos critérios de elegibilidade e consentimento informado, os participantes foram submetidos aos critérios de inclusão e exclusão e posteriormente alocados aleatoriamente em grupos controle ou intervenção. O método de alocação sequencial foi baseado em números sequenciais. O primeiro paciente foi aleatoriamente designado para intervenção ou grupo controle, e os seguintes pacientes foram alocados sequencialmente alternadamente para cada grupo. Foi atribuída uma codificação a cada participante de forma a manter o anonimato e garantir a confidencialidade dos dados.

Após um período de jejum de 8-10 horas, o grupo controle recebeu OGTT e o grupo de intervenção recebeu OGTT seguido de extrato aquoso de baobá.

Preparação de extrato aquoso de baobá:

O fruto do baobá foi adquirido no mercado de Benfica, localizado na cidade de Luanda (Angola) e trazido para Lisboa (Portugal) devidamente acondicionado em saco plástico e armazenado em local seco e ambiental até a sua utilização. Para a extração aquosa do fruto foram pesados ​​40 ± 1 g de polpa, sementes e filamentos vermelhos e o fruto foi fervido em 300 ml de água por 5 minutos. Após resfriamento lento até a temperatura ambiente, o extrato foi colocado em geladeira em um recipiente onde permaneceu por 8 horas a uma temperatura média de 10°C. O BAE foi peneirado com auxílio de peneira de rede, separando-o das sementes e filamentos, sendo posteriormente submetido ao ensaio clínico e aos ensaios antioxidantes. Para os ensaios antioxidantes, após a filtração, o extrato foi passado pelo liquidificador (Kenwood Multipro Compact Food Processor FDP302SI), filtrado novamente obtendo amostras homogêneas, evitando a formação de precipitados durante a análise. A concentração final do extrato aquoso obtido, tanto para ensaio clínico quanto para análise química, foi de 0,1333 g Adansonia digitata L. (AD)/ml peso fresco (PF) do extrato.

Intervenções:

Após jejum noturno, a glicemia foi avaliada por meio de gota capilar de sangue, imediatamente antes do Teste Oral de Tolerância à Glicose (t0). Os participantes do grupo controle ingeriram solução de glicose isolada (OGTT) preparada com 75 g de glicose anidra oral prescrita pela American Dietetic Association (ADA), dissolvida em 200 ml de água. O grupo intervenção ingeriu solução de glicose seguida de 250 ml de extrato aquoso de baobá (33,33 g FW). O nível de glicose no sangue também foi medido em 30 (t30), 60 (t60), 90 (t90) e 120 (t120) minutos imediatamente após a intervenção, para cada participante, nos grupos controle e intervenção. Foram utilizados glicosímetros, tiras para medidores de glicose (One Touch Select Plus) e lancetas esterilizadas (Sarstedt normal 21G) para medir as concentrações de glicose no sangue, com os devidos cuidados de segurança e assepsia. Com base nos valores de glicemia, a área incremental de glicose no sangue sob a curva (AUCi) de cada participante foi definida usando o programa GraphPad Prism (versão 5.0). As concentrações máximas (Cmax) e as variações das concentrações máximas (ΔCmax) foram determinadas comparando-as com seus respectivos valores basais de glicemia.

Avaliação dos parâmetros antropométricos:

Foram também recolhidos os parâmetros antropométricos, nomeadamente, peso, altura e índice de massa corporal (IMC). O IMC foi calculado como peso (Kg) dividido pela altura (m2) ao quadrado (Kg/m2). O peso corporal foi estimado por bioimpedância, por meio da balança Inbody®, modelo 230.

Avaliação da ingestão dietética:

Os participantes do estudo preencheram um questionário alimentar de 24 horas, que foram cuidadosamente instruídos por um investigador para identificar todos os alimentos consumidos. A quantidade de cada alimento ingerido foi estimada com auxílio de fotos. Foi utilizado um livro com fotos de refeições em diferentes tamanhos. O investigador revisou o questionário juntamente com o participante. A ingestão alimentar de cada participante foi analisada por meio do software The Food Processor SQL (versão 11.3.285) obtenção de energia total, carboidratos, proteínas e lipídios significam ingestão.

Avaliação do conteúdo de fenóis totais, proantocianidinas e taninos hidrolisáveis:

A concentração de fenólicos totais foi determinada de acordo com o método de Folin Ciocalteu empregando ácido gálico como padrão. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico/L (GAE/L). Para esta análise, 125 μl de BAE, previamente diluído (x15) em água e 125 μl de etanol foram adicionados a 2,5 ml de solução reagente de Folin-Ciocalteu (1:10 diluída em H2O) e 2 ml de carbonato de sódio aquoso (Na2CO3). 1M. Após 15 minutos, a absorbância foi medida a 765 nm.

O teor de proantocianidinas foi determinado de acordo com o método de Gu et al (2002) com modificações, que se baseia na hidrólise ácida de polímeros de proantocianidinas produzindo pigmentos avermelhados em solução quente de 1-butanol/ácido clorídrico. Foram adicionados 200 μl de BAE diluído (x2) a 200 μl de metanol e 2600 μl de solução de HCl/1-butanol 10%(v/v). Os tubos de ensaio foram agitados e incubados a 100°C por 50 minutos. A absorbância foi medida a 550 nm. Os resultados são expressos em mg equivalentes de proantocianidinas A2/L (EPA2/L).

O método de Willis e Allen foi adaptado para a determinação dos taninos hidrolisáveis ​​do BAE. Um volume de 1 ml de extrato foi adicionado a 5 ml de iodato de potássio a 2,5% (KIO3). A mistura foi então agitada e voltou ao banho-maria a 25°C por 20 minutos. A leitura da absorbância foi realizada por espectrofotômetro a 550 nm e os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido tânico/L (TAE/L).

Ensaios antioxidantes:

Método do Poder Antioxidante Redutor Férrico (FRAP): o efeito antioxidante (capacidade redutora) foi avaliado monitorando a formação de uma coloração azul intensa do complexo Fe2+ TPTZ, de acordo com o ensaio do Poder Antioxidante Redutor Férrico (FRAP). Um volume de 2850µl (25ml solução tampão acetato 300mM pH=3,6 mais 2,5 ml solução 10mM TPTZ em HCl 40mM + 2,5 ml 20mM FeCl3.6H2O solução) foi adicionado a 150µl de BAE diluído. Os tubos foram mantidos no escuro por 30 minutos (7 ensaios em diferentes concentrações). A absorbância foi determinada em 593 nm e os resultados foram expressos em mg de equivalentes de Trolox/L (TE/L).

Método ABTS: este método baseou-se na capacidade de uma amostra inibir o radical ABTS (ABTS+) em comparação com um padrão antioxidante de referência (Trolox). O radical ABTS+ foi gerado por reação química com persulfato de potássio (K2S2O8). Assim, 25 ml de ABTS (7 mM) foram adicionados a 440 µl de K2S2O8 (140 mM) e deixados no escuro à temperatura ambiente por 12-16 h. A solução foi preparada tomando um volume da solução anterior e diluindo-o em etanol até que sua absorbância em λ = 734 nm fosse 0,70. Os tubos foram mantidos no escuro por 30 minutos. Os resultados expressos em mg de equivalentes Trolox/L (TE/L).

O método DPPH: este método foi determinado pelo sequestrador de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil. Um volume de 150 μl de BAE foi adicionado a 2850 μl de solução de DPPH previamente preparada em metanol com λ=515 nm de 1,1. As soluções foram mantidas por 24 horas na ausência de luz. A absorbância foi determinada a 515 nm e os resultados expressos em mg de equivalentes Trolox/L (TE/L).

Capacidade de inibição do ânion O2•- e do radical NO:

O ânion superóxido é gerado pela oxidação do NADH ao reagir com o PMS e o oxigênio, causando a redução do NBT. Um volume de 500 μl de BAE com concentração diferente foi adicionado a 2 ml de NADH (189μM) e NBT (120 μM) em tampão Tris-HCl 40 mM pH 8. A reação foi iniciada após a adição de 0,5 ml de PMS (60 μM) e após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 560 nm.

O teste de inibição do radical NO foi baseado no método de Nikkhah e colaboradores (2008). Um volume de 250 μl de BAE com diferentes concentrações foi adicionado a 1 ml de nitroprussiato de sódio e 250 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A mistura foi mantida por 150 minutos a 25°C. Em seguida, 0,5 ml dessa mistura foi adicionada a 1 ml de ácido sulfanílico (0,33% em ácido acético glacial 20%) e mantida por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 1 ml de NED (0,1% p/v) e manteve-se essa mistura por 30 minutos a 25°C. Ao final da reação formou-se um cromóforo rosa. A absorvância foi medida a 540 nm. A porcentagem de inibição dos radicais O2•- e NO foi determinada pela equação 1 e os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico (GAE)/L.

Análise estatística:

A análise estatística foi realizada com os softwares Excel® e SPSS® (Statistical Package for Social Sciences) versão 27.0 para Mac. Os dados são apresentados como média ± DP (desvio padrão) e SEM (erro padrão da média). ANOVA de medição repetida do tipo misto foi usada para avaliar a diferença entre os 2 grupos para glicemia pós-prandial em momentos diferentes. O teste t de amostras independentes foi usado para avaliar a diferença entre os 2 grupos para parâmetros antropométricos, ingestão total de energia, carboidratos, proteínas e lipídios, valores de Cmax, ΔCmax e AUCi. Todos os testes estatísticos foram realizados com nível de significância de 5%.