Papel da Microbiota Fecal na Previsão de Rejeição de Enxerto e Sepse Entre Receptores de Transplante de Fígado de Doador Vivo no Primeiro Ano.

Objetivo primário:

Caracterizar as alterações da microbiota fecal ao longo de um ano após o transplante hepático de doador vivo e sua associação com rejeição do enxerto e sepse.

Objetivos secundários:

1. Incidência de disfunção do enxerto atribuível à sepse, rejeição e infecção por CMV no primeiro ano de LDLT.
2. Estudar o perfil imunológico pré-LT e sua correlação com rejeição pós-transplante, necessidade de imunossupressão e restauração da imunossenescência.
3. Correlacionar as mudanças dinâmicas em células imunes e citocinas na previsão de rejeição de enxerto e sepse.

DESENHO DO ESTUDO Tipo de estudo - Estudo observacional, prospectivo, de centro único População do estudo - 100 pacientes consecutivos preenchendo os critérios de elegibilidade e submetidos a transplante de fígado de doador vivo em ILBS entre abril de 2020 a março de 2022.

Duração do estudo - 24 meses a partir da data de aprovação do IEC

Metodologia:

Identificação da microbiota intestinal:

Extração de DNA Todos os indivíduos serão submetidos à coleta de soro e fezes no mesmo dia. Serão recolhidos cerca de 5-8 g de material fecal. O QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit para amostras de fezes será utilizado para a extracção de ADN.

Amplificação por PCR do Gene 16s RNA Resumidamente, a amplificação por PCR das regiões hipervariáveis ​​V3-V4 será feita usando os primers 341F e 806R contendo o código de barras específico da amostra. O produto amplificado purificado (QIAGEN) será executado na plataforma MiSeq com leituras de primer de sequenciamento personalizado 1 (R1), leitura 2 (R2) e índice.

Sangue total: Será coletado sangue total (5-10ml). O plasma será separado por centrifugação a 2500rpm. O plasma será armazenado a -80C em biobanco (NLDB) até ser processado para matriz de citocinas. O sangue restante será tratado com tampão de lise de hemácias e será processado para análise de células imunes.

Imunofenotipagem para frequência/número absoluto de células imunes: As células no sangue total serão coradas com anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo específicos para os marcadores de superfície para subconjuntos de células T (Th1, Th2, Th17, Tregs), células reguladoras B usando citometria de fluxo e análise será feito pelo software FCS express.

Arranjo de citocinas: As citocinas pró-inflamatórias (IL-1β) e anti-inflamatórias (IL-10) serão dosadas no plasma dos pacientes em estudo. O kit de matriz de citocinas será adquirido comercialmente e será feito de acordo com as instruções do fabricante.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

• Os dados serão relatados como média + SD
• As variáveis ​​categóricas serão comparadas usando o teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher
• Variáveis ​​contínuas normais serão comparadas usando o teste t de Student
• Variáveis ​​contínuas não normais serão comparadas usando o teste Mann-Whitney rank-sum (dados não pareados) ou o teste de Wilcoxon (dados pareados).
• A comparação entre grupos em variáveis ​​quantitativas será analisada por ANOVA Uma análise de regressão de Cox será realizada para identificar fatores prognósticos independentes para a função do enxerto.

PONTOS TERMINAIS DO ESTUDO Ponto final primário

• Desenvolvimento de sepse, rejeição, infecção por CMV
• Morte

Pontos finais secundários

• Complicações pós-TH que requerem intervenções cirúrgicas
• Retransplante

Resultado esperado do projeto:

1. Isso nos ajudará a projetar ferramentas de diagnóstico simples com base em perfis microbianos ou assinaturas de células imunes para diagnóstico de disfunção do enxerto e sepse.
2. Isso também nos dará uma visão sobre o mecanismo da patogênese imunológica durante o desenvolvimento de condições graves e isso abrirá caminho para novas opções terapêuticas.

Questões éticas no estudo e planos para lidar com essas questões - Nenhuma