Роль фекальной микробиоты в прогнозировании отторжения трансплантата и сепсиса среди реципиентов печени от живого донора в первый год.

Основная цель:

Охарактеризовать изменения фекальной микробиоты в течение года после трансплантации печени от живого донора и ее связь с отторжением трансплантата и сепсисом.

Второстепенные цели:

1. Частота дисфункции трансплантата, связанная с сепсисом, отторжением и инфекцией ЦМВ в первый год LDLT.
2. Изучить иммунологический профиль до ТП и его взаимосвязь с посттрансплантационным отторжением, потребностью в иммуносупрессии и восстановлением иммуносенесценции.
3. Сопоставить динамические изменения иммунных клеток и цитокинов при прогнозировании отторжения трансплантата и сепсиса.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Тип исследования — одноцентровое, проспективное, обсервационное исследование Исследуемая группа — последовательные 100 пациентов, отвечающих критериям приемлемости и перенесших трансплантацию печени от живого донора в рамках ILBS в период с апреля 2020 года по март 2022 года.

Продолжительность исследования - 24 месяца с момента утверждения МЭК

Методология:

Идентификация кишечной микробиоты:

Экстракция ДНК. У всех испытуемых в тот же день будет произведен сбор сыворотки и кала. Будет собрано около 5-8 г фекального материала. Для выделения ДНК будет использоваться мини-набор QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit для образцов стула.

ПЦР-амплификация гена РНК 16s Вкратце, ПЦР-амплификация гипервариабельных областей V3-V4 будет проводиться с использованием праймеров 341F и 806R, содержащих специфический для образца штрих-код. Очищенный амплифицированный продукт (QIAGEN) будет запускаться на платформе MiSeq с пользовательскими чтениями праймера для секвенирования 1 (R1), чтением 2 (R2) и индексом.

Цельная кровь: Будет собрана цельная кровь (5-10 мл). Плазму отделяют центрифугированием при 2500 об/мин. Плазма будет храниться при температуре -80°C в биобанке (NLDB) до тех пор, пока она не будет обработана для получения массива цитокинов. Оставшуюся кровь обработают буфером для лизиса эритроцитов и обработают для анализа иммунных клеток.

Иммунофенотипирование по частоте/абсолютному количеству иммунных клеток: Клетки в цельной крови будут окрашены специфическими меченными флуорохромом моноклональными антителами к поверхностным маркерам субпопуляций Т-клеток (Th1, Th2, Th17, Treg), В-регуляторных клеток с использованием проточной цитометрии и анализа. будет выполнено с помощью программного обеспечения FCS Express.

Массив цитокинов: Провоспалительные (IL-1β) и противовоспалительные цитокины (IL-10) будут измеряться в плазме исследуемых пациентов. Набор массивов цитокинов будет приобретаться на коммерческой основе и будет производиться в соответствии с инструкциями производителя.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

• Данные будут представлены как среднее + SD
• Категориальные переменные будут сравниваться с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера.
• Нормальные непрерывные переменные будут сравниваться с использованием критерия Стьюдента.
• Ненормальные непрерывные переменные будут сравниваться с использованием критерия суммы рангов Манна-Уитни (непарные данные) или критерия Уилкоксона (парные данные).
• Сравнение между группами по количественным переменным будет проанализировано с помощью ANOVA. Будет проведен регрессионный анализ Кокса для определения независимых прогностических факторов функции трансплантата.

КОНЕЧНЫЕ ТОЧКИ ИССЛЕДОВАНИЯ Первичная конечная точка

• Развитие сепсиса, отторжение, ЦМВ-инфекция
• Смерть

Вторичные конечные точки

• Осложнения после ТП, требующие хирургических вмешательств
• Ретрансплантация

Ожидаемый результат проекта:

1. Это поможет нам в разработке простых диагностических инструментов, основанных на микробном профилировании или сигнатурах иммунных клеток, для диагностики дисфункции трансплантата и сепсиса.
2. Это также даст нам представление о механизме иммунного патогенеза при развитии тяжелых состояний и проложит путь к новым терапевтическим возможностям.

Этические проблемы в исследовании и планы по решению этих проблем - нет