Sputum Matrix Metalloproteinases (MMP) mRNA och Montelukast

Följande mätningar kommer att utföras vid screening:

• Informerat samtycke
• Klinisk undersökning
• Spirometri
• Inducerat sputum

Följande kommer att utföras efter 8 veckors studiemedicinering:

• Klinisk undersökning
• Spirometri
• Inducerat sputum
• Dagbokskort

Spirometri:

Detta kommer att utföras med en Microlab-spirometer (Micro Medical Ltd, Rochester, Kent, Storbritannien). Förfarandet kommer att vara enligt American Thoracic Societys specifikationer(13).

Dagbokskortsdata:

Patienterna kommer att registrera sina symtom dagligen på morgonen enligt "hosta", "andnöd" och "väsande andning" på en 4-gradig skala med 0=inga symtom och 3=maximala symtom. En total symtompoäng kommer att beräknas av 12. Patienterna kommer också att mäta sitt maximala utandningsflöde på en daglig basis på morgonen och registrera den högsta av tre mätningar. De kommer att registrera att de har tagit sin studiemedicin.

Sputuminduktion och undersökning:

Sputum kommer att erhållas med hyperton koksaltlösning genom den metod som beskrivs av Pizzichini et al(14) genom att inhalera ökande koncentrationer av koksaltlösning (3, 4 och 5%) vardera under 7 minuter, genom ett munstycke. Efter varje inandningsperiod kommer FEV1 att mätas för säkerhets skull. Försökspersonerna kommer att uppmanas att hosta sputum i en steril behållare. Totalt cellantal av leukocyter kommer att erhållas i en modifierad Neubauer hemocytometer. Cellviabiliteten kommer att bestämmas med trypanblått-uteslutningsmetoden. Fyrahundra icke skivepitelceller kommer att räknas i Wright-färgade objektglas och resultaten kommer att uttryckas som en procentandel och ett absolut tal av det totala antalet icke skivepitelvävnader. Mätning av MMP-9, 12 TIMP-1 och TGFb kommer att utföras i sputumsupernatant.

Profil för mRNA för MMP och TIMP:

Totalt RNA kommer att extraheras från cellinnehållet i den inducerade sputumpluggen med en kombination av Trizol-extraktion och Qiagen RNeasy-spinkolonner på ett liknande sätt som tidigare beskrivits12. Kvantitativ RT-PCR, med användning av tidigare utvecklade primrar och prober, kommer att användas för att bestämma de relativa kvantiteterna av mRNA från MMPs och TIMPs enligt beskrivning12. Vi är fortfarande det enda centret i världen som rutinmässigt profilerar hela MMP- och TIMP-genfamiljen i mänskliga prover. Detta ger en heltäckande bild av involveringen av dessa enzymer och inhibitorer i sjukdomsprocessen och belyser även potentiella nya biomarkörer. Möjligheten att utöka genprofileringen utan behov av ytterligare sputuminsamling ger också ett mervärde till forskningen. Detta kan inkludera andra proteinasfamiljer med roller i ECM-nedbrytning eller vid inflammation.