ARNm de metaloproteinasas de matriz de esputo (MMP) y montelukast

Las siguientes mediciones se realizarán en la selección:

• Consentimiento informado
• Exámen clinico
• Espirometría
• esputo inducido

Se realizará lo siguiente después de 8 semanas de medicación del estudio:

• Exámen clinico
• Espirometría
• esputo inducido
• Tarjeta de diario

Espirometría:

Esto se realizará con un espirómetro Microlab (Micro Medical Ltd, Rochester, Kent, Reino Unido). El procedimiento será de acuerdo con las especificaciones de la American Thoracic Society(13).

Datos de la tarjeta de diario:

Los pacientes registrarán sus síntomas diariamente por la mañana de acuerdo con "tos", "dificultad para respirar" y "sibilancias" en una escala de 4 puntos con 0 = sin síntomas y 3 = síntomas máximos. Se calculará una puntuación total de síntomas a partir de 12. Los pacientes también medirán su flujo espiratorio máximo diariamente por la mañana y registrarán la mayor de las tres mediciones. Registrarán que han tomado la medicación del estudio.

Inducción y examen de esputo:

El esputo se obtendrá con solución salina hipertónica por el método descrito por Pizzichini et al(14) inhalando concentraciones crecientes de solución salina (3, 4 y 5%) cada una durante 7 minutos, a través de una boquilla. Después de cada período de inhalación, se medirá el FEV1 por seguridad. Se pedirá a los sujetos que tosan esputo en un recipiente estéril. El recuento celular total de leucocitos se obtendrá en un hemocitómetro Neubauer modificado. La viabilidad celular se determinará mediante el método de exclusión con azul tripán. Se contarán 400 células no escamosas en portaobjetos teñidos con Wright y los resultados se expresarán como porcentaje y número absoluto del recuento total no escamoso. La medición de MMP-9, 12 TIMP-1 y TGFb se realizará en el sobrenadante de esputo.

Perfil de mRNA de MMP y TIMPs:

El ARN total se extraerá del contenido celular del tapón de esputo inducido mediante una combinación de extracción con Trizol y columnas giratorias Qiagen RNeasy de forma similar a la descrita anteriormente12. La RT-PCR cuantitativa, utilizando cebadores y sondas previamente desarrollados, se utilizará para determinar las cantidades relativas de ARNm de MMP y TIMP como se describe12. Seguimos siendo el único centro en el mundo que perfila rutinariamente toda la familia de genes MMP y TIMP en muestras humanas. Esto brinda una visión completa de la participación de estas enzimas e inhibidores en el proceso de la enfermedad y también arroja luz sobre nuevos biomarcadores potenciales. La posibilidad de ampliar el perfil genético sin la necesidad de una recolección de esputo adicional también agrega valor a la investigación. Esto podría incluir otras familias de proteinasas con funciones en la descomposición de la MEC o en la inflamación.