Metalloproteinasi della matrice dell'espettorato (MMP) mRNA e Montelukast

Durante lo screening verranno eseguite le seguenti misurazioni:

• Consenso informato
• Esame clinico
• Spirometria
• Espettorato indotto

Quanto segue verrà eseguito dopo 8 settimane di trattamento in studio:

• Esame clinico
• Spirometria
• Espettorato indotto
• Carta del diario

Spirometria:

Questo verrà eseguito con uno spirometro Microlab (Micro Medical Ltd, Rochester, Kent, Regno Unito). La procedura sarà conforme alle specifiche dell'American Thoracic Society(13).

Dati della carta del diario:

I pazienti registreranno i loro sintomi su base giornaliera al mattino in base a "tosse", "mancanza di respiro" e "respiro sibilante" su una scala a 4 punti con 0=nessun sintomo e 3=sintomi massimi. Verrà calcolato un punteggio totale dei sintomi su 12. I pazienti misureranno anche il loro flusso espiratorio di picco su base giornaliera al mattino e registreranno la più alta delle tre misurazioni. Registreranno che hanno assunto il farmaco dello studio.

Induzione ed esame dell'espettorato:

L'espettorato sarà ottenuto con soluzione fisiologica ipertonica secondo il metodo descritto da Pizzichini et al(14) inalando concentrazioni crescenti di soluzione fisiologica (3, 4 e 5%) ciascuna per 7 minuti, attraverso un boccaglio. Dopo ogni periodo di inalazione, il FEV1 sarà misurato per sicurezza. Ai soggetti verrà chiesto di tossire l'espettorato in un contenitore sterile. Il conteggio totale delle cellule dei leucociti sarà ottenuto in un emocitometro di Neubauer modificato. La vitalità cellulare sarà determinata mediante il metodo di esclusione del trypan blue. Quattrocento cellule non squamose saranno contate in vetrini colorati con Wright ei risultati saranno espressi come percentuale e numero assoluto del conteggio totale non squamoso. La misurazione di MMP-9, 12 TIMP-1 e TGFb sarà eseguita nel supernatante dell'espettorato.

Profilo dell'mRNA di MMP e TIMP:

L'RNA totale sarà estratto dal contenuto cellulare del tappo dell'espettorato indotto utilizzando una combinazione di estrazione con Trizol e colonne Qiagen RNeasy spin in modo simile a quanto descritto in precedenza12. La RT-PCR quantitativa, utilizzando primer e sonde sviluppati in precedenza, sarà utilizzata per determinare le quantità relative di mRNA di MMP e TIMP come descritto12. Rimaniamo l'unico centro al mondo a profilare regolarmente l'intera famiglia di geni MMP e TIMP in campioni umani. Ciò offre una visione onnicomprensiva del coinvolgimento di questi enzimi e inibitori nel processo patologico e fa anche luce su potenziali nuovi biomarcatori. Anche la possibilità di espandere il profilo genetico senza la necessità di un'ulteriore raccolta di espettorato aggiunge valore alla ricerca. Ciò potrebbe includere altre famiglie di proteinasi con ruoli nella rottura dell'ECM o nell'infiammazione.