Ett forskningsprotokoll för att utvärdera effektiviteten av perfuserade kemoterapeutiska medel för blåscancer baserat på organoidteknologi

1. Bakgrund Blåscancer är en elakartad tumör som härrör från urinblåsan i urinblåsan och står för första gången i förekomsten av genitourinära tumörer i Kina. Bland dem är urinblåsancancer den vanligaste och står för mer än 90% av cancer i urinblåsan. Beroende på djupet av tumörinvasionen i urinblåsan och de prognostiska egenskaperna klassificeras blåscancer kliniskt i icke-muskelinvasiv blåscancer (NMIBC) och muskelinvasiv blåscancer (MIBC), med NMIBC som huvudtyp, vilket står för cirka 75 % av alla cancerpatienter i urinblåsan.

   NMIBC behandlas vanligtvis med Transurethral Resection of Bladder Tumor (TURBt). Trots att det är i de tidiga stadierna av sjukdomen har NMIBC en hög recidivfrekvens, med studier som rapporterar en 5-årig recidivfrekvens på cirka 70 %. Därför har postoperativ blåperfusionskemoterapi blivit en viktig terapeutisk åtgärd för att förhindra återfall av blåscancer. I mer än 60 år har människor utforskat mer effektiva blåperfusionsläkemedel och metoder. 1961 användes Thiotepa för blåsperfusionsterapi och fick en viss grad av effektivitet för att förhindra återkommande ytliga tumörer i urinblåsan. 1976 trodde Morales att cancer i urinblåsan var relaterad till immunbrister, och följaktligen har BCG-blåsperfusionsterapi varit extremt framgångsrik och skapat ett nytt sätt för immunterapi för blåstumörer , som har uppskattats mycket och fortfarande anses vara det mest effektiva blåsperfusionsläkemedlet. BCG-instillation kan dock orsaka allvarliga biverkningar, inklusive urinrörs- och prostatagranulom, blåsirritation, feber, hematuri och andra lokala manifestationer och systemiska influensaliknande symtom, vilket resulterar i intolerans och avbrott i behandlingen hos vissa patienter, vilket har begränsat den breda kliniska tillämpning av BCG. Studier har visat att intravesikal instillation av kemoterapeutiska medel i urinblåsan kan minska återfallsfrekvensen av ytlig blåscancer på kort sikt med cirka 15 %-20 % och den långsiktiga återfallsfrekvensen med cirka 6 %. För närvarande finns det många val av kemoterapeutiska medel vid blåsinstillation, inklusive (1) pirenzolubicin; (2) gemcitabin; (3) mitomycin; (4) epirubicin; (5) doxorubicin; (6) alternerande blåsinfusionskemoterapi med gemcitabin och pirenzolubicin; och (7) andra kombinerade infusionskemoterapier. Men på grund av det stora utbudet av kemoterapeutiska läkemedel bygger läkemedelsurvalet mest på klinisk erfarenhet eller vissa forskningsresultat, det finns ingen enhetlig standard, och den är blind, empirisk och randomiserad. Kinesiska urologiska sjukdomsdiagnos och riktlinjer för behandling gav inte heller valet av perfusionsläkemedel, och enskilda patienter för vissa kemoterapeutiska läkemedel visar naturlig resistens, när kliniken fastställer att patienten inte är känslig för användningen av läkemedlet, har läkemedlet producerat allvarliga toxiska biverkningar, och till och med leda till fenomenet multiläkemedelsresistens (multidrogresistens, MDR), så att den kliniska återfallsfrekvensen fortfarande är så hög som 36%-44%, och samtidigt tumör av denna grupp av patienter fortskrider snabbt, förlorar möjligheten att välja behandlingsmetod igen. Därför har hur man undviker valet av primära läkemedelsresistenta läkemedel och direkt väljer läkemedel med hög känslighet för att uppnå individualiserad kemoterapi blivit en het punkt i forskningen om blåperfusionskemoterapi.

   Förverkligandet av precisionstumörterapi beror i hög grad på upptäckten av läkemedelskänslighet. Genom exakta individualiserade kemoterapeutiska läkemedelsscreeningsexperiment kan den mest effektiva och minst toxiska terapeutiska regimen bedömas för varje patient innan behandlingen påbörjas, så att föreslå en kemoterapeutisk regim för en enskild patient är en ny forskningsriktning för att förverkliga precisionsbehandlingen av blåscancer och för att förbättra effektiviteten av blåscancerkemoterapi. Tidigare var de mer vanligt förekommande prekliniska modellerna traditionella tumörcellinjer och mänskligt härledda tumörvävnadsxenotransplantat (PDX). Tumörcellinjeodlingsmetoden är enkel men otillräcklig för att simulera tillväxttillståndet hos tumörceller hos patienter, och de läkemedel som screenas av dess läkemedelsscreeningssystem har lågt värde för klinisk tillämpning.PDX, även om det kan simulera in vivo-tumöregenskaper och bevara tumören mikromiljö, har uppenbara begränsningar såsom låg stabil tumörframkallande egenskaper, lång modellerings- och utvärderingsperiod (ett halvt år till ett år), tidskrävande och arbetskrävande, och det är svårt att generera och använda för läkemedelsscreening med hög genomströmning. Därför har utvecklingen av analysmodeller för läkemedelskänslighet som kan efterlikna heterogeniteten och komplexiteten hos blåscancer blivit nödvändig för att utveckla mer personliga terapeutiska och förebyggande strategier för att minimera risker och optimera effektiviteten av medicinska insatser genom att rikta in sig på den unika genetiska, miljömässiga och livsstilsegenskaper hos individer.

   Patient-derived Organoids (PDO) är organoida 3D-strukturer som bildas av stamceller som är självmonterade in vitro, som kan differentieras till flera organspecifika celltyper och kan uppvisa cell-cell och cell-omgivande matrisinteraktioner och rumsliga lokaliseringsmönster, som återskapar in vitro några av nyckelfunktionerna och strukturerna hos verkliga organ, och har en stabil fenotyp. strukturer med stabila fenotypiska och genetiska egenskaper. Jämfört med tvådimensionella tumörcellinjer och PDX kan tumörorganoider odlas direkt med hjälp av patientens egna vävnader, och samtidigt kan dessa organoider väl replikera några av de primära tumörernas nyckelegenskaper, behålla patomorfologin och biologiska mekanismer. av patientens vävnader, och bevara heterogeniteten i tumörvävnaderna och en mer realistisk tumörmikromiljö, samt ha en kort tillväxtcykel. Det är användbart för dess användning på kliniska cancerpatienter för läkemedelskänslighetstestning av strålbehandlingsläkemedel, molekylärt inriktade läkemedel, antitumörantikroppar och andra läkemedel, för att förutsäga patientens känslighet för läkemedel, med potential att hjälpa till vid kliniska behandlingsbeslut.

   Under 2018 rapporterade Science en studie om användningen av metastaserande gastrointestinala tumörliknande organ för läkemedelskänslighetstestning, som jämförande analyserade skillnaderna i känslighet mellan 21 kliniska patienter och deras motsvarande PDO för en serie riktade och kemoterapeutiska läkemedel, och resultaten visade stark överensstämmelse mellan de två. I jämförelse med de faktiska patientutfallen förutspåddes PDO:erna väl (sensitivitet 100 %, specificitet 93 %, positivt prediktivt värde 88 % och negativt prediktivt värde 100 %).20 År 2020 konstruerade Yao Y et al 96 rektalcancerorganoider med hjälp av biopsier från 112 fall av lokalt avancerad rektalcancer och valde ut 80 av dem för att testa deras svar på strålbehandling, och resultaten visade att rektalcancerorganoider var känsliga för strålbehandling och patientens kliniskt svar. Resultaten visade att känsligheten hos organoider av rektalcancer för strålbehandling överensstämde i hög grad med det kliniska svaret hos patienterna (sensitivitet 78 %, specificitet 92 %, noggrannhet 84 %). Därefter, i tumörer som magcancer och bröstcancer, fann man också överensstämmelse mellan PDO och tumörpatienters svar på läkemedel. Yan HHN et al konstruerade ett magcancerorganoidbibliotek med användning av tumörvävnader, paracancerösa vävnader och lymfkörtelmetastaser från 34 magcancerpatienter. Två av dem utvecklade tumörmetastaser och genomgick en kombination av cisplatin och 5-FU efter operation, som båda svarade bra. Det andra fallet fick kemoterapi före operationen och svarade inte på capecitabin efter operationen. Undersökning av känsligheten hos motsvarande föreningar av PDO i dessa tre fall visade att läkemedelskänsligheten för PDO stämde perfekt överens med det kliniska svaret hos varje patient. Guillen KP et al konstruerade PDX och PDO med hjälp av tumörprover från endokrinterapiresistenta, patienter med återfall och metastaserande bröstcancer, och dessa prover undersöktes histomorfologiskt, genomiskt och läkemedelskänslighet. Resultaten visade att både bröstcancer PDX och PDO var starkt reducerande av de histobiologiska och genomiska egenskaperna hos deras ursprungstumörer, och båda svarade konsekvent på antitumörläkemedel. En patient med trippelnegativ bröstcancer i stadium IIA utvecklade i denna studie levermetastaser cirka 1 år efter att ha genomgått preoperativ kemoterapi och kirurgisk behandling. Utredarna utsatte konstruktionerna PDO och PDX för ex vivo läkemedelskänslighetstestning och fann att mikrotubulinhibitorn eribulin hade den bästa terapeutiska effekten. Baserat på detta resultat instruerades patienterna att genomgå behandling med eribulin, vilket resulterade i fullständig remission av levermetastaser i nästan 5 månader efter dosering. Dessa studier bekräftar i viss mån möjligheten med PDO för att styra medicineringen av patienter med kliniska tumörer. Det har också visat sig att genom att jämföra skillnaden i respons på läkemedel mellan normalliknande organ och PDO har man funnit att läkemedel med hög selektivitet hjälper till att minska toxiska biverkningar hos kliniska patienter. Således är det tydligt att läkemedelskänslighetstestning av PDO för att upptäcka den mest lämpliga läkemedelsregimen kommer att bidra till att förbättra den kliniska effekten av tumörpatienter, minska toxiska biverkningar, risk för läkemedelsresistens och chanser för tumörrecidiv och maximera fördelarna med patienter.

   Därför kommer vi, med utgångspunkt från patienthärledda organoidmodeller för blåscancer, att utföra icke-muskelinvasiva blåscancerperfusionskemoterapiexperiment för läkemedelskänslighetstestning, upprätta ett standardiserat läkemedelskänslighetstestsystem för organoider av urinblåscancer och formulera screeningstandarder för läkemedelskänslighetstestning av organoider av blåscancer, för att screena den optimala läkemedelskombinationsregimen, hjälpa till med den kliniska utvecklingen av nya individualiserade behandlingsprotokoll och utföra klinisk multicentervalidering för att uppnå en sann "ersättningsläkemedelstestning".

2. Forskningsfrågor och mål Forskningsfrågor: Denna studie jämför den ettåriga tumörfria återfallsöverlevnaden och den treåriga tumörfria återfallsöverlevnaden för patienter i den organoidkänsliga läkemedelsinfusionsgruppen, den organoidokänsliga läkemedelsinfusionsgruppen, och BCG-infusionsgruppen med hjälp av en kohortstudie, och skillnaden i återfallsfrekvensen mellan de tre grupperna jämförs med envägs K-M-överlevnadsanalys. Bedömning för att utvärdera värdet av tumörliknande organläkemedelskänslighetsanalyser för att vägleda individuell perfusionskemoterapi för cancer i urinblåsan.

   Forskningsmål: att bedöma tillämpningsvärdet av tumörliknande organläkemedelskänslighetsexperiment för att vägleda individuell perfusionskemoterapi för blåscancer genom att observera den kliniska effekten av tumörliknande organläkemedelskänslighetsmetod för att vägleda postoperativ perfusionskemoterapi för urinblåscancerpatienter.

   Se Resultatmått för detaljer

3. Forskningsmetodik 3.1 Studiedesign Detta protokoll är baserat på de tekniska riktlinjerna för kliniska prövningar av antineoplastiska läkemedel och antar en multicenter, kohortstudie.

3.1.1 Gruppering Se Grupper och interventioner för detaljer 3.1.2 Blåscancer organoid preparat

1. Provtagning av blåscancer Provtagningsprocessen är i enlighet med sjukhusets etik och undertecknat informerat samtycke. Patienter som ingår i experimentet måste patologiskt diagnostiseras med blåscancer, och storleken på tumörprover som tas kirurgiskt bör vara större än 0,8 cm*3 så långt det är möjligt, för patologisk verifiering, organoidodling, läkemedelskänslighetstest, och så vidare. Tumörvävnader bör samlas in med hänsyn till vävnadsischemitid och kryokonservering, och uppsamlingstiden bör vara inom 5 minuter när vävnaderna avlägsnas från den mänskliga blodcirkulationen, för att undvika stressnekros av tumörvävnaderna på grund av tidig hypoxi.
2. Förberedelse av blåscancerorgan I processen med vävnadsbearbetning användes fysisk krossning och kollagenasuppslutning för att bearbeta vävnadsproverna, och de bearbetade och smälta organoiderna behövde filtreras genom cellsilar med olika diametrar före odling, för att göra de erhållna organoiderna enhetliga i storlek och underlätta enande av standarder. Sedan planterades de i tredimensionell matrisgel och odlades i speciellt medium.
3. Expansion och odling av organoider i urinblåsan Organoidernas tillväxtstatus observerades mikroskopiskt, och immunhistokemi och immunfluorescens användes för att karakterisera organoiderna, för att bekräfta närvaron av tumörceller och för att utvärdera deras morfologi. Carcinoida organ i urinblåsan passerade och frystes.

3.1.3 Testning av känslighet för organoid läkemedelskänslighet för urinblåscancertumör Efter att ha observerat antalet organoider under mikroskop för att nå det antal som kan utsättas för läkemedelskänslighetstestning, aspirerades det organoida mediet och kasserades. Tillsätt 3 mL matsmältningslösning till petriskålen, blås isär dropparna, smält vid 37 ℃, blås organoiderna och observera under mikroskop, när organoiderna smälts till en homogen cellmassa innehållande 2-3 celler, tillsätt 2 gånger volymen av matsmältningslösningen för att avsluta matsmältningen. 1500 rpm, centrifugera cellerna i 3 minuter och aspirera sedan och kassera supernatanten.

Återsuspendera cellerna med medium, försök att inte producera luftbubblor och späd ut medium till gel i förhållandet 1:1,5, inokulera sedan den blandade gelén med 10 ul/brunn med en enkanalspipett i förkylda 384-brunnars plattor med 3 000 organoider per brunn (denna operation utfördes på is). Efter blandning av mediet med gummit i ett förhållande av 1:1 (40 uL:40 uL), fördelades mediet i 384-brunnars plattan med 10 uL/brunn som en blank grupp. Efter att försiktigt knacka på plattan med 384 brunnar så att geldropparna låg platt på botten av brunnarna, placerades plattan i en inkubator i 30 minuter för att tillåta geldropparna att stelna och förvärmt BCOs-medium tillsattes vid 40 uL /väl. Till läkemedelstestbrunnarna såväl som till de tomma brunnarna runt kontrollbrunnarna sattes 40 uL PBS-lösning och placerades i en koldioxidinkubator för att förhindra vätskan från att avdunsta och få geldropparna att torka ut.

Efter 3 dagars inkubation och observation utfördes mikroskopisk observation av provets status i varje brunn för halvvolymsvätskebyte.

Utforma läkemedelskänslighetstestprotokollet enligt kraven i följande tabell, ställ in kontrollgruppen, blankgruppen och läkemedelstestgruppen, läkemedlet löstes upp enligt instruktionerna och späddes 4-faldigt till 6 koncentrationer med organoid medium, respektive; med hjälp av luminiscerande cellviabilitetsanalys testades läkemedlet vid olika koncentrationer av den semi-inhiberande koncentrationen (IC50), hämning av tumörceller (IR), graden av avvikelse för IC50 från läkemedelskoncentrationen i blodet, AUC (area under dosen -responskurva), utvärderingskriterierna för resultaten av läkemedelskänslighetsanalysen tar IC50 och IR som huvudindex, tillsammans med graden av avvikelse för IC50 från läkemedelskoncentrationen i blodet och AUC-resultaten som hjälpbedömning (för detaljer, se 3.10.3), att bedöma effekterna på överlevnaden och spridningen av klassen av organismer, och att ge den kliniska vägledningen för användningen av läkemedlet.

Tabell 1 Metoder för att gruppera läkemedelskänslighetstest Grupperingsmetod för läkemedelskänslighetstestning Tom grupp: Ingen organoid, inget läkemedel tillsatt, 6 replikatbrunnar per platta. Kontrollgrupp: Inokulerad med organoider, ingen tillsatt läkemedelsexponering. Läkemedelstestgrupp: Inokulerad med organoid, lägg till läkemedelsexponering. 3.1.4 Läkemedelskombinationsregimer för kemoterapi Tabell 2 Perfusionskemoterapiläkemedel Gemcitabin □ Pirorubicin □ Epirubicin □ Silvestrol □ Adriamycin(doxorubicin) □ 3.2 Studieplats och studiepopulation (källa och uteslutningskriterier för inkludering) Se studiedesign för detaljer 3.3 Studier Variabler och Studier positiva. kontrollgruppen utsattes inte för organoidodling samt testning av organoidläkemedelskänslighet.

De återstående patienterna utsattes för organoid läkemedelskänslighetstestning i enlighet med läkemedelskänslighetstestprotokollet, med användning av luminescerande cellviabilitetsanalys för att testa läkemedlets semi-inhiberande koncentration (IC50), hämningshastighet (IR) av tumörcellerna, graden av avvikelse för IC50 från läkemedelskoncentrationen i blodet och AUC (arean under dos-responskurvan) vid olika koncentrationer, och utvärderingskriterierna för resultaten av läkemedelskänslighetstestning baserades på IC50,IR som huvudindex med IC50-avvikelsen från läkemedelskoncentrationen i blodet, resulterar AUC som en extra bedömning (se 3.10.3 för detaljer), för att bedöma dess effekt på överlevnad och spridning av klassorgan.

Patienter som genomgick organoidodling och testning av läkemedelskänslighet genomgick blåsinstillation av kemoterapeutiska medel enligt erfarenhet från läkare. De fem perfunderade läkemedlen inkluderade gemcitabin, piroxikam, epirubicin, mitomycin och adriamycin (doxorubicin). Beroende på känsligheten hos deras perfusionsläkemedel i organoidläkemedelskänslighetstest, delades de in i organoidkänsliga läkemedelsperfusionsgrupper och organoid icke-känsliga läkemedelsperfusionsgrupper. Perfusionsbehandling: inklusive induktionsperfusionskemoterapi (4-8 veckor efter operationen, 1 gång per vecka, totalt 4 gånger) och underhållsperfusionskemoterapi (1 gång per månad, 11 gånger totalt).

BCG-infusionsregim: 6 induktionsinfusioner följt av 3 boosterinfusioner en gång varannan vecka för att upprätthålla ett bra immunsvar, följt av 10 underhållsinfusioner en gång i månaden för totalt 19 infusioner under 1 år.

Kliniska mätningar: de två grupperna av patienter i den organoid-känsliga läkemedelsperfusionsgruppen och den organoid-icke-känsliga läkemedelsperfusionsgruppen följdes upp och analyserades för de primära och sekundära studiens ändpunkter, och envägs Kaplan-Meier överlevnadsanalys utfördes för att jämföra skillnaderna i återfallsfrekvens mellan de två grupperna. COX riskproportionmodellen användes för att analysera återfallsriskkvoten för patienters kön, ålder, tumörstadium och grad mellan de två grupperna.

3.4 Studieresultat RECIST1.1-kriterier användes för effektutvärdering, och Choi-kriterier och mRECIST-kriterier användes som hjälpkriterier för effektutvärdering.

Primära studieresultat: ett års tumörrecidivfri överlevnad, tre års tumörrecidivfri överlevnad.

Sekundära effektmått: ett års tumörprogressionsfri överlevnad, tre års tumörprogressionsfri överlevnad.

3.5 Uppföljning De två grupperna av patienter i den organliknande känsliga läkemedelsperfusionsgruppen och den organliknande icke-känsliga läkemedelsperfusionsgruppen följdes upp och analyserades för de primära och sekundära studiens effektmått.

Cystoskopi är den metod man väljer när man granskar patienter med NMIBC och det finns inget icke-invasivt alternativ till cystoskopi. Därför bör NMIBC-uppföljning baseras på regelbunden cystoskopi. Om misstänkta lesioner i blåsslemhinnan påträffas vid undersökningen bör biopsi göras för att klargöra de patologiska fynden. Urinexfoliativ cytologi, CT/CTU eller MRI/MRU utförs vid behov, men ingen av dem kan helt ersätta cystoskopi.

Cystoskopiöversiktsplanen: lågrisk-NMIBC görs en gång vid 3 månader och 12 månader efter operation under det första året och en gång om året därefter fram till det tredje året; NMIBC med medelrisk görs en gång 3 månader, 6 månader och 12 månader efter operationen, var 6:e ​​månad under det andra året och varje år därefter fram till det tredje året; högrisk-NMIBC görs var tredje månad under de första två åren och var sjätte månad därefter fram till det tredje året.

3.6 Urvalsstorlek En urvalsstorlek på 293 fall var tillräcklig för att uppfylla kraven för studiens effektmått.

Det fanns 73 fall i den organoida icke-känsliga läkemedelsperfusionsgruppen och 110 fall vardera i den organoidkänsliga läkemedelsperfusionsgruppen och den positiva kontrollgruppen.

Beräkningsgrund:

1. Beräkning av provstorleken för studiens ettåriga tumörfria överlevnadsgrad: den ettåriga tumörfria överlevnaden förväntas vara 73 % i den organoidkänsliga läkemedelsinfusionsgruppen och 50 % i den organoida icke-känsliga läkemedelsinfusionsgrupp, med ensidig α=0,05, β=0,2, och förhållandet mellan provstorlekarna för de två grupperna är 1 (experimentgrupp: kontrollgrupp), provstorlekarna för de två grupperna är 55 fall i experimentgruppen, 55 fall i kontrollgruppen och 110 fall i den positiva kontrollgruppen. 55 fall i kontrollgruppen, totalt 110 fall, och med tanke på 20 % avfall krävs en total urvalsstorlek på 138 fall.
2. Beräkna provstorleken enligt ändpunkten för den treåriga tumörfria överlevnadsstudien: det förväntas att den treåriga tumörfria överlevnaden för den organoidkänsliga läkemedelsinfusionsgruppen kommer att vara 63 %, och tre- års tumörfri överlevnad för den organoid-okänsliga läkemedelsinfusionsgruppen kommer att vara 40 %, och den ensidiga α=0,05, β=0,2, och förhållandet mellan provstorlekarna för de två grupperna kommer att vara 1 (experimentgrupp: kontrollgrupp ), så att urvalsstorlekarna för de två grupperna kommer att beräknas som 58 fall i försöksgruppen, 58 fall i kontrollgruppen och 11 fall i kontrollgruppen, med hänsyn tagen till 20 % utsläpp, och en total provstorlek på 138 ärenden kommer att krävas. 58 fall i kontrollgruppen, totalt 116 fall, och med tanke på 20 % avfall krävdes en total urvalsstorlek på 146 fall.
3. Enligt resultaten av litteraturen är den ettåriga tumörfria överlevnaden för den positiva kontrollgruppen 75 %, och enligt förtestet är den ettåriga tumörfria överlevnaden för den organoidkänsliga läkemedelsinfusionen grupp förväntas vara 73 %, och gränsvärdet för icke-underlägsenhet är 0,2 (kontrollgrupp-experimentell grupp), och förhållandet mellan urvalsstorlekarna för de två grupperna är ett med den ensidiga alfa 0,05 och beta är 0,2 , beräknas provstorleken för de två grupperna som 74 fall av den organoidkänsliga läkemedelsinfusionsgruppen, 74 fall av den positiva kontrollgruppen och totalt 116 fall av experimentgruppen. 74 fall och 74 fall i den positiva kontrollgruppen, totalt 148 fall. Med tanke på 20 % avfall är den totala provstorleken som krävs 186 fall.
4. Enligt resultaten av litteraturen är den treåriga tumörfria överlevnaden för den positiva kontrollgruppen 65 %, och enligt förtestet den treåriga tumörfria överlevnaden för den organoidkänsliga läkemedelsinfusionen grupp förväntas vara 63 %, och gränsvärdet för icke-underlägsenhet är 0,2 (kontrollgrupp-testgrupp), och förhållandet mellan urvalsstorlekarna för de två grupperna är 1 om den ensidiga alfa är 0,05 och beta är 0,2 beräknas provstorleken för de två grupperna som 88 fall av den organoidkänsliga läkemedelsinfusionsgruppen och 88 fall av den positiva kontrollgruppen. 88 fall och 88 fall i den positiva kontrollgruppen, totalt 176 fall, och med hänsyn tagen till 20 % utsöndring krävdes en total provstorlek på 220 fall.

3.7 Flödesschema över forskningstekniker Detta avsnitt (bilder) beskriver projektets tekniska väg. 3.8 Datainsamling och hantering Data samlades in genom observation och registrering, och de ursprungliga uppgifterna kontrollerades punkt för punkt för att säkerställa att uppgifterna överensstämde med dem i de ursprungliga dokumenten. I slutet av experimentet överlämnades det till statistikern för statistisk analys.

3.9 Statistiska analysmetoder Mätdata är generellt beskrivande statistik med medelvärden, standardavvikelse, median, minimi- och maximivärden. För kategoriska variabler kommer deskriptiv statistik att utföras enligt frekvens och procent.

Statistisk programvara SPSS användes för statistisk analys. Mätdata uttrycktes som medel ± standardavvikelse (x ± s), t-test, envägs ANOVA (post hoc-test två-och-två-jämförelser med LSD-metoden), chi-kvadrattest användes för jämförelse av hastigheter, och Spearmans metod användes för korrelationsanalyser. p < 0,05 ansågs att skillnaden var statistiskt signifikant.

3.10 Kvalitetskontroll 3.10.1 Klassorgan HE-färgning och immunhistokemiresultat Överensstämmer med de patologiska testresultaten, vilket indikerar att de konstruerade organoid- och tumörproverna bättre kan bibehålla patologisk stabilitet.

3.10.2 Organoid WES- eller RNA-Seq-analys Konstruerade organoid- och tumörprover kan bättre behålla genetisk stabilitet. 3.10.3 Utvärderingskriterier för läkemedelskänslighetstestresultat Utvärderingsstandarden för läkemedelskänslighetstestresultat har IC50,IR som huvudindex, med graden av avvikelse mellan IC50 och blodläkemedelskoncentration, AUC-resultat som en hjälpbedömning, när IC50, IR-känsliga index träffas samtidigt, anses det som känsligt; när det inte är möjligt att uppfylla IC50, IR-index samtidigt, IC50 kombinerat med IC50 och behovet av koncentrationen av förhållandet mellan den mindre graden av skillnad i resultaten av känsligheten.

3.10.3.1 IC50-utvärderingskriterier. IC50>20× Ej känslig

1×<IC50≤20× Låg känslighet 0,5×<IC50≤1× Måttligt känslig IC50≤0,5× högkänsliga Den känsliga gruppen inkluderar starkt känsliga och måttligt känsliga, och den okänsliga gruppen inkluderar svagt känsliga och resistenta.

3.10.3.2 Utvärderingskriterier för IR-tumörhämningshastighet. IR <30 % är okänslig och klassificerad som negativ; IR≥30% är känslig och klassificerad som positiv, där 30%≤IR<50% är låg känslighet, 50%≤IR<70% är måttlig känslighet och IR≥70% är hög känslighet.

Känslighetsgrad = antal fall med IR ≥ 30% / totalt antal fall i gruppen.

3.10.3.3 Beräkning av graden av avvikelse för IC50 från blodkoncentration: graden av avvikelse från blodkoncentration avser graden av skillnad mellan IC50-värdet som erhållits från läkemedelskänslighetstestet och blodkoncentrationen, och beräknas som IC50/blodkoncentration.

Ju mindre förhållandet är, desto effektivare är läkemedlet. 3.10.3.4 Kriterier för utvärdering av AUC-resultat (area under läkemedels-tid-kurvan): Den specifika beräkningen av AUC involverar vanligtvis integrering av koncentration-tid-kurvan.

AUC är nära relaterat till dos-responssambandet. I dos-responskurvan för läkemedelseffektivitet är AUC en sammansatt indikator på den totala effekten av ett läkemedel på en organism mellan dos och respons. En större AUC är vanligtvis förknippad med en bättre terapeutisk effekt.

3.11 Behandling av organoid efter studie De organoider som konstruerats framgångsrikt i denna studie kommer att destrueras enhetligt och kasseras efter studien i enlighet med normerna för bortskaffande av biomedicinskt avfall.