Un protocollo di ricerca per valutare l'efficacia degli agenti chemioterapici perfusi per il cancro alla vescica basato sulla tecnologia organoide

1. Background Il cancro della vescica è un tumore maligno che origina dall'uroepitelio della vescica, e rappresenta il primo posto nell'incidenza dei tumori genito-urinari in Cina. Tra questi, il cancro uroepiteliale della vescica è il più comune e rappresenta oltre il 90% dei tumori della vescica. In base alla profondità dell’invasione tumorale nella vescica e alle caratteristiche prognostiche, il cancro della vescica è clinicamente classificato in cancro della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC) e cancro della vescica muscolo-invasivo (MIBC), con NMIBC come tipo principale, che rappresenta circa il 75% di tutti i pazienti affetti da cancro della vescica.

   L'NMIBC viene solitamente trattato con la resezione transuretrale del tumore della vescica (TURBt). Nonostante sia nelle fasi iniziali della malattia, l'NMIBC presenta un elevato tasso di recidiva, con studi che riportano un tasso di recidiva a 5 anni di circa il 70%. Pertanto, la chemioterapia di perfusione vescicale postoperatoria è diventata una misura terapeutica chiave per prevenire le recidive del cancro della vescica. Per più di 60 anni, si sono esplorati farmaci e metodi di perfusione vescicale più efficaci. Nel 1961, Thiotepa è stato utilizzato per la terapia di perfusione vescicale e ha guadagnato un certo grado di efficacia nel prevenire la recidiva di tumori superficiali della vescica. Nel 1976, Morales riteneva che il cancro della vescica fosse correlato a deficienze immunitarie e di conseguenza la terapia di perfusione vescicale con BCG ha avuto un enorme successo, creando un nuovo modo di immunoterapia per i tumori della vescica. , che è stato ampiamente apprezzato ed è ancora considerato il farmaco più efficace per la perfusione della vescica. Tuttavia, l’instillazione di BCG può causare gravi effetti collaterali, inclusi granulomi uretrali e prostatici, irritazione della vescica, febbre, ematuria e altre manifestazioni locali e sintomi simil-influenzali sistemici, con conseguente intolleranza e interruzione del trattamento in alcuni pazienti, il che ha limitato l’ampia gamma clinica applicazione del BCG. Gli studi hanno dimostrato che l’instillazione intravescicale di agenti chemioterapici nella vescica può ridurre il tasso di recidiva a breve termine del cancro superficiale della vescica di circa il 15%-20% e il tasso di recidiva a lungo termine di circa il 6%. Attualmente esistono molte scelte di agenti chemioterapici per l'instillazione della vescica, tra cui (1) pirenzolubicina; (2) gemcitabina; (3) mitomicina; (4) epirubicina; (5) doxorubicina; (6) alternanza di chemioterapia con infusione vescicale con gemcitabina e pirenzolubicina; e (7) altre chemioterapie a infusione combinata. Tuttavia, a causa dell’ampia varietà di farmaci chemioterapici, la selezione dei farmaci si basa principalmente sull’esperienza clinica o su determinati risultati della ricerca, non esiste uno standard uniforme ed è cieca, empirica e randomizzata. Inoltre, le linee guida cinesi per la diagnosi e il trattamento delle malattie urologiche non prevedono la selezione dei farmaci per la perfusione, e i singoli pazienti per alcuni farmaci chemioterapici mostrano una resistenza naturale, quando la clinica determina che il paziente non è sensibile all'applicazione del farmaco, il farmaco ha prodotto gravi effetti collaterali tossici e persino portare al fenomeno della multi-resistenza ai farmaci (resistenza multi-farmaco, MDR), in modo che il tasso di recidiva clinico sia ancora alto quanto il 36% -44%, e allo stesso tempo, il il tumore di questo gruppo di pazienti progredisce rapidamente, perdendo l'opportunità di riselezionare il metodo di trattamento. Pertanto, come evitare la selezione di farmaci primari resistenti ai farmaci e scegliere direttamente farmaci ad alta sensibilità per ottenere una chemioterapia personalizzata è diventato un punto caldo nella ricerca sulla chemioterapia della perfusione vescicale.

   La realizzazione di una terapia tumorale di precisione dipende in gran parte dal rilevamento della sensibilità ai farmaci. Attraverso precisi esperimenti individualizzati di screening dei farmaci chemioterapici, è possibile giudicare il regime terapeutico più efficace e meno tossico per ciascun paziente prima dell'inizio del trattamento, in modo da proporre un regime chemioterapico per un singolo paziente è una nuova direzione di ricerca per realizzare il trattamento di precisione del cancro della vescica e per migliorare l’efficienza della chemioterapia del cancro della vescica. In precedenza, i modelli preclinici più comunemente utilizzati erano le linee cellulari tumorali tradizionali e gli xenotrapianti di tessuto tumorale di derivazione umana (PDX). Il metodo di coltura della linea cellulare tumorale è semplice ma insufficiente per simulare lo stato di crescita delle cellule tumorali nei pazienti e i farmaci selezionati dal suo sistema di screening farmacologico hanno un basso valore per l'applicazione clinica. PDX, sebbene possa simulare le caratteristiche del tumore in vivo e preservare il tumore microambiente, presenta evidenti limitazioni come una tumorigenicità bassa e stabile, un lungo periodo di modellazione e valutazione (da mezzo anno a un anno), dispendioso in termini di tempo e laborioso, ed è difficile da generare e utilizzare per lo screening farmacologico ad alto rendimento. Pertanto, lo sviluppo di modelli di test di sensibilità ai farmaci in grado di imitare l’eterogeneità e la complessità del cancro della vescica è diventato necessario al fine di sviluppare strategie terapeutiche e preventive più personalizzate per ridurre al minimo il rischio e ottimizzare l’efficacia degli interventi medici prendendo di mira le caratteristiche genetiche, ambientali uniche. e le caratteristiche dello stile di vita degli individui.

   Gli organoidi derivati ​​dal paziente (PDO) sono strutture organoidi 3D formate da cellule staminali autoassemblate in vitro, che possono essere differenziate in più tipi cellulari organo-specifici e possono mostrare interazioni cellula-cellula e matrice cellula-circostante e modelli di posizione spaziale, ricreando in vitro alcune delle funzioni e strutture chiave degli organi reali e aventi un fenotipo stabile. strutture con caratteristiche fenotipiche e genetiche stabili. Rispetto alle linee cellulari tumorali bidimensionali e al PDX, gli organoidi tumorali possono essere coltivati ​​direttamente utilizzando i tessuti del paziente e, allo stesso tempo, questi organoidi possono replicare bene alcune delle caratteristiche chiave dei tumori primari, conservare la patomorfologia e i meccanismi biologici dei tessuti del paziente, e preservare l'eterogeneità dei tessuti tumorali e un microambiente tumorale più realistico, oltre ad avere un ciclo di crescita breve. È utile per il suo utilizzo nei pazienti oncologici clinici per test di sensibilità ai farmaci radioterapici, farmaci per il targeting molecolare, anticorpi antitumorali e altri farmaci, per prevedere la risposta del paziente ai farmaci, con il potenziale di assistere nelle decisioni sul trattamento clinico.

   Nel 2018, Science ha riportato uno studio sull'uso di organi metastatici simili a tumori gastrointestinali per i test di sensibilità ai farmaci, che ha analizzato comparativamente le differenze di sensibilità tra 21 pazienti clinici e i loro corrispondenti PDO a una serie di farmaci mirati e chemioterapici, e i risultati hanno mostrato forte coerenza tra i due. Rispetto ai risultati effettivi dei pazienti, i PDO erano ben previsti (sensibilità 100%, specificità 93%, valore predittivo positivo 88% e valore predittivo negativo 100%).20 Nel 2020, Yao Y et al hanno costruito 96 organoidi del cancro del retto utilizzando biopsie di 112 casi di cancro del retto localmente avanzato e ne hanno selezionati 80 per testare la loro risposta alla radioterapia, e i risultati hanno mostrato che gli organoidi del cancro del retto erano sensibili alla radioterapia e all'azione del paziente risposta clinica. I risultati hanno mostrato che la sensibilità degli organoidi del cancro del retto alla radioterapia era altamente coerente con la risposta clinica dei pazienti (sensibilità 78%, specificità 92%, accuratezza 84%). Successivamente, in tumori come il cancro gastrico e il cancro della mammella, è stata riscontrata anche la concordanza tra PDO e risposta ai farmaci dei pazienti affetti da tumore. Yan HHN et al. hanno costruito una libreria di organoidi del cancro gastrico utilizzando tessuti tumorali, tessuti paracancerosi e metastasi linfonodali di 34 pazienti affetti da cancro gastrico. Due di loro hanno sviluppato metastasi tumorali e sono stati sottoposti a una combinazione di cisplatino e 5-FU dopo l'intervento chirurgico, entrambi i quali hanno risposto bene. L'altro caso ha ricevuto chemioterapia prima dell'intervento chirurgico e non ha risposto alla capecitabina dopo l'intervento. L'esame della sensibilità dei corrispondenti composti della PDO in questi tre casi ha mostrato che la sensibilità al farmaco della PDO era in perfetto accordo con la risposta clinica di ciascun paziente. Guillen KP et al. hanno costruito PDX e PDO utilizzando campioni di tumore provenienti da campioni di tumore resistenti alla terapia endocrina, pazienti con cancro al seno recidivato e metastatico e questi campioni sono stati esaminati dal punto di vista istomorfologico, genomico e della sensibilità ai farmaci. I risultati hanno mostrato che sia il cancro al seno PDX che il PDO erano altamente riducenti delle proprietà istobiologiche e genomiche dei tumori di origine ed entrambi rispondevano in modo coerente ai farmaci antitumorali. Una paziente con carcinoma mammario triplo negativo in stadio IIA in questo studio ha sviluppato metastasi epatiche circa 1 anno dopo essere stata sottoposta a chemioterapia preoperatoria e trattamento chirurgico. I ricercatori hanno sottoposto i costrutti PDO e PDX a test di sensibilità ai farmaci ex vivo e hanno scoperto che l'inibitore dei microtubuli eribulina aveva il miglior effetto terapeutico. Sulla base di questo risultato, i pazienti sono stati istruiti a sottoporsi a un trattamento con eribulina, che ha portato alla completa remissione delle metastasi epatiche per quasi 5 mesi dopo la somministrazione. Questi studi confermano in una certa misura la possibilità della PDO di guidare la terapia dei pazienti con tumori clinici. È stato inoltre dimostrato che confrontando la differenza nella risposta ai farmaci tra organi normali e PDO, si è riscontrato che i farmaci ad alta selettività aiutano a ridurre gli effetti collaterali tossici nei pazienti clinici. Pertanto, è chiaro che i test di sensibilità ai farmaci mediante PDO per scoprire il regime farmacologico più appropriato contribuiranno a migliorare l’efficacia clinica dei pazienti affetti da tumore, a ridurre gli effetti collaterali tossici, il rischio di resistenza ai farmaci e le possibilità di recidiva del tumore, e a massimizzare i benefici per la malattia. pazienti.

   Pertanto, basandoci su modelli di organoidi del cancro della vescica derivati ​​dal paziente, condurremo esperimenti di test di sensibilità ai farmaci chemioterapici e perfusionali non muscolo-invasivi del cancro della vescica, stabiliremo un sistema standardizzato di test di sensibilità ai farmaci per gli organoidi del cancro della vescica e formuleremo standard di screening per i test di sensibilità ai farmaci di organoidi del cancro della vescica, in modo da selezionare il regime ottimale di combinazione di farmaci, assistere nello sviluppo clinico di nuovi protocolli di trattamento individualizzati ed effettuare una validazione clinica multicentrica per ottenere un vero "test dei farmaci sostitutivi".

2. Domande e obiettivi della ricerca Domande della ricerca: questo studio confronta il tasso di sopravvivenza da recidiva libera da tumore a un anno e il tasso di sopravvivenza da recidiva libera da tumore a tre anni dei pazienti nel gruppo con infusione di farmaci sensibile agli organoidi, nel gruppo con infusione di farmaci insensibile agli organoidi, e il gruppo di infusione di BCG mediante uno studio di coorte, e la differenza nel tasso di recidiva tra i tre gruppi viene confrontata mediante un’analisi di sopravvivenza KM a una via. Valutazione per valutare il valore dei test di sensibilità ai farmaci per organi simil-tumorali nel guidare la chemioterapia di perfusione individuale per il cancro della vescica.

   Obiettivo della ricerca: valutare il valore applicativo degli esperimenti di sensibilità ai farmaci per organi simil-tumorali nel guidare la chemioterapia di perfusione individuale per il cancro della vescica osservando l'efficacia clinica del metodo di sensibilità ai farmaci per organi simil-tumorali nel guidare la chemioterapia di perfusione postoperatoria per i pazienti con cancro della vescica.

   Vedi Misure di risultato per i dettagli

3. Metodologia della ricerca 3.1 Disegno dello studio Il presente protocollo si basa sulle Linee Guida Tecniche per la Sperimentazione Clinica dei Farmaci Antineoplastici e adotta uno studio multicentrico e di coorte.

3.1.1 Raggruppamento Per i dettagli vedere Gruppi e interventi 3.1.2 Preparazione di organoidi per il cancro della vescica

1. Raccolta dei campioni di cancro alla vescica Il processo di raccolta dei campioni è conforme all'etica ospedaliera e al consenso informato firmato. Ai pazienti arruolati nell'esperimento deve essere diagnosticato patologicamente un cancro alla vescica e la dimensione dei campioni tumorali prelevati chirurgicamente deve essere il più grande possibile superiore a 0,8 cm*3, per la verifica patologica, la coltura di organoidi, il test di sensibilità ai farmaci e così via. I tessuti tumorali devono essere raccolti prestando attenzione al tempo di ischemia dei tessuti e alla crioconservazione, e il tempo di raccolta deve essere entro 5 minuti quando i tessuti vengono rimossi dalla circolazione sanguigna umana, in modo da evitare la necrosi da stress dei tessuti tumorali dovuta all'ipossia precoce.
2. Preparazione degli organi per il cancro alla vescica Nel processo di lavorazione dei tessuti, sono state utilizzate la frantumazione fisica e la digestione della collagenasi per elaborare i campioni di tessuto e gli organoidi trasformati e digeriti dovevano essere filtrati attraverso setacci cellulari di diverso diametro prima della coltura, in modo da produrre gli organoidi ottenuti dimensioni uniformi e facilitare l’unificazione degli standard. Quindi sono stati piantati in gel di matrice tridimensionale e coltivati ​​in un terreno speciale.
3. Espansione e coltura degli organoidi del cancro della vescica Lo stato di crescita degli organoidi è stato osservato al microscopio e l'immunoistochimica e l'immunofluorescenza sono state utilizzate per caratterizzare gli organoidi, per confermare la presenza di cellule tumorali e per valutare la loro morfologia. Gli organi carcinoidi del cancro alla vescica sono stati espiantati e congelati.

3.1.3 Test di sensibilità ai farmaci per gli organoidi del tumore della vescica Dopo aver osservato il numero di organoidi al microscopio per raggiungere il numero che può essere sottoposto al test di sensibilità ai farmaci, il mezzo organoide è stato aspirato e scartato. Aggiungere 3 ml di soluzione digestiva alla capsula di Petri, soffiare via le goccioline, digerire a 37 ℃, soffiare gli organoidi e osservare al microscopio, quando gli organoidi vengono digeriti in una massa cellulare omogenea contenente 2-3 cellule, aggiungere 2 volte la quantità volume della soluzione digestiva per terminare la digestione. 1500 giri/min, centrifugare le cellule per 3 minuti, quindi aspirare ed eliminare il surnatante.

Risospendere le cellule con il terreno, cercare di non produrre bolle d'aria e diluire il terreno con il gel in rapporto 1:1,5, quindi inoculare il gel misto a 10 µL/pozzetto con una pipetta a canale singolo in piastre da 384 pozzetti preraffreddate con 3.000 organoidi per pozzo (questa operazione è stata eseguita su ghiaccio). Dopo aver miscelato il mezzo con la gomma in un rapporto di 1:1 (40 uL:40 uL), il mezzo è stato dispensato nella piastra da 384 pozzetti a 10 uL/pozzetto come gruppo bianco. Dopo aver picchiettato delicatamente la piastra da 384 pozzetti in modo che le goccioline di gel giacessero piatte sul fondo dei pozzetti, la piastra è stata posta in un incubatore per 30 minuti per consentire alle goccioline di gel di solidificarsi e il terreno BCO preriscaldato è stato aggiunto a 40 uL /BENE. Ai pozzetti del test antidroga così come ai pozzetti vuoti attorno ai pozzetti di controllo, sono stati aggiunti 40 uL di soluzione PBS e posti in un incubatore a biossido di carbonio per evitare che il liquido evaporasse e provocasse l'essiccazione delle gocce di gel.

Dopo 3 giorni di incubazione e osservazione, è stata effettuata l'osservazione microscopica dello stato del campione in ciascun pozzetto per lo scambio di fluido di metà volume.

Progettare il protocollo del test di sensibilità al farmaco in base ai requisiti della tabella seguente, impostare il gruppo di controllo, il gruppo bianco e il gruppo del test antidroga, il farmaco è stato sciolto secondo le istruzioni e diluito rispettivamente 4 volte in 6 concentrazioni con mezzo organoide; utilizzando il test di vitalità cellulare luminescente, il farmaco è stato testato a diverse concentrazioni di concentrazione semi-inibitoria (IC50), inibizione delle cellule tumorali (IR), grado di deviazione dell'IC50 dalla concentrazione del farmaco nel sangue, AUC (area sotto la dose -curva di risposta), i criteri di valutazione dei risultati del test di sensibilità al farmaco assumono IC50 e IR come indici principali, insieme al grado di deviazione di IC50 dalla concentrazione ematica del farmaco e i risultati dell'AUC come giudizio ausiliario (per i dettagli, fare riferimento a 3.10.3), valutare gli effetti sulla sopravvivenza e sulla proliferazione della classe di organismi e fornire indicazioni cliniche sull'uso del farmaco.

Tabella 1 Metodi per raggruppare i test di sensibilità ai farmaci Metodo di raggruppamento dei test di sensibilità ai farmaci Gruppo vuoto: nessun organoide, nessun farmaco aggiunto, 6 pozzetti replicati per piastra. Gruppo di controllo: inoculato con organoidi, senza esposizione a farmaci aggiunti. Gruppo test antidroga: inoculato con organoide, aggiunta dell'esposizione al farmaco. 3.1.4 Regimi di combinazione di farmaci chemioterapici Tabella 2 Farmaci chemioterapici per perfusione Gemcitabina □ Pirorubicina □ Epirubicina □ Silvestrolo □ Adriamicina (doxorubicina) □ 3.2 Centro di studio e popolazione di studio (fonte e criteri di esclusione di inclusione) Vedere il disegno dello studio per i dettagli 3.3 Variabili (fattori) e misurazioni dello studio I positivi il gruppo di controllo non è stato sottoposto alla coltura degli organoidi né ai test di sensibilità ai farmaci organoidi.

I restanti pazienti sono stati sottoposti a test di sensibilità ai farmaci organoidi in conformità con il protocollo di test di sensibilità ai farmaci, utilizzando un test di vitalità cellulare luminescente per testare la concentrazione semi-inibitoria (IC50) del farmaco, il tasso di inibizione (IR) delle cellule tumorali, il grado della deviazione dell'IC50 dalla concentrazione del farmaco nel sangue e dell'AUC (l'area sotto la curva dose-risposta) a diverse concentrazioni, e i criteri di valutazione dei risultati dei test di sensibilità ai farmaci erano basati sull'IC50,IR come indici principali con la deviazione IC50 dalla concentrazione del farmaco nel sangue, l'AUC risulta come giudizio ausiliario (vedere 3.10.3 per i dettagli), per valutarne l’effetto sulla sopravvivenza e sulla proliferazione degli organi di classe.

I pazienti sottoposti a coltura di organoidi e test di sensibilità ai farmaci sono stati sottoposti a instillazione vescicale di agenti chemioterapici secondo l'esperienza dei medici. I cinque farmaci perfusi includevano gemcitabina, piroxicam, epirubicina, mitomicina e adriamicina (doxorubicina). In base alla sensibilità dei loro farmaci di perfusione nel test di sensibilità ai farmaci organoidi, sono stati divisi in gruppo di perfusione ai farmaci organoidi sensibili e gruppo di perfusione ai farmaci organoidi non sensibili. Regime di perfusione: inclusa chemioterapia di perfusione di induzione (4-8 settimane dopo l'intervento chirurgico, 1 volta a settimana, 4 volte in totale) e chemioterapia di perfusione di mantenimento (1 volta al mese, 11 volte in totale).

Regime di infusione di BCG: 6 infusioni di induzione seguite da 3 infusioni di richiamo una volta ogni 2 settimane per mantenere una buona risposta immunitaria, seguite da 10 infusioni di mantenimento una volta al mese per un totale di 19 infusioni in 1 anno.

Misurazioni cliniche: i due gruppi di pazienti nel gruppo di perfusione con farmaci organoidi sensibili e nel gruppo di perfusione con farmaci organoidi non sensibili sono stati seguiti e analizzati per gli endpoint primari e secondari dello studio ed è stata eseguita l'analisi di sopravvivenza Kaplan-Meier unidirezionale confrontare le differenze nei tassi di recidiva tra i due gruppi. Il modello di proporzione del rischio COX è stato utilizzato per analizzare il rapporto di rischio di recidiva tra sesso, età, stadio e grado del tumore tra i due gruppi.

3.4 Risultati dello studio I criteri RECIST1.1 sono stati utilizzati per la valutazione dell'efficacia, mentre i criteri Choi e mRECIST sono stati utilizzati come criteri ausiliari di valutazione dell'efficacia.

Endpoint primari dello studio: tasso di sopravvivenza libera da recidiva del tumore a un anno, tasso di sopravvivenza libera da recidiva del tumore a tre anni.

Endpoint secondari: tasso di sopravvivenza libera da progressione del tumore a un anno, tasso di sopravvivenza libera da progressione del tumore a tre anni.

3.5 Follow-up I due gruppi di pazienti nel gruppo con perfusione farmacologica organo-simile e nel gruppo con perfusione farmacologica non sensibile organo-simile sono stati seguiti e analizzati per gli endpoint primari e secondari dello studio.

La cistoscopia è il metodo di scelta quando si esaminano i pazienti con NMIBC e non esiste un'alternativa non invasiva alla cistoscopia. Pertanto, il follow-up dell’NMIBC dovrebbe basarsi su una cistoscopia regolare. Se durante l'esame si riscontrano lesioni sospette della mucosa vescicale, è necessario eseguire la biopsia per chiarire i risultati patologici. Se necessario, vengono eseguite citologia esfoliativa urinaria, TC/CTU o MRI/MRU, ma nessuna di queste può sostituire completamente la cistoscopia.

Il piano di revisione della cistoscopia: l'NMIBC a basso rischio viene eseguito una volta a 3 mesi e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico nel 1° anno, e successivamente una volta all'anno fino al 3° anno; L'NMIBC a rischio intermedio viene eseguito una volta a 3 mesi, 6 mesi e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico, ogni 6 mesi nel 2° anno e successivamente ogni anno fino al 3° anno; L'NMIBC ad alto rischio viene effettuato ogni 3 mesi nei primi 2 anni e successivamente ogni 6 mesi fino al 3° anno.

3.6 Dimensione del campione Una dimensione del campione di 293 casi era sufficiente per soddisfare i requisiti per gli endpoint dello studio.

Ci sono stati 73 casi nel gruppo di perfusione con farmaci organoidi non sensibili e 110 casi ciascuno nel gruppo di perfusione con farmaci organoidi sensibili e nel gruppo di controllo positivo.

Base di calcolo:

1. Calcolo della dimensione del campione per l'endpoint dello studio sul tasso di sopravvivenza libera da tumore a un anno: si prevede che il tasso di sopravvivenza libera da tumore a un anno sia del 73% nel gruppo con infusione di farmaci sensibile agli organoidi e del 50% nel gruppo non sensibile agli organoidi gruppo di infusione del farmaco, con α unilaterale = 0,05, β = 0,2 e il rapporto tra le dimensioni del campione dei due gruppi è 1 (gruppo sperimentale: gruppo di controllo), le dimensioni del campione dei due gruppi sono 55 casi nel gruppo sperimentale, 55 casi nel gruppo di controllo e 110 casi nel gruppo di controllo positivo. 55 casi nel gruppo di controllo, per un totale di 110 casi, e considerando un calo del 20%, è necessaria una dimensione totale del campione di 138 casi.
2. Calcolare la dimensione del campione in base all'endpoint dello studio sul tasso di sopravvivenza libera da tumore a tre anni: si prevede che il tasso di sopravvivenza libera da tumore a tre anni del gruppo di infusione del farmaco sensibile agli organoidi sarà del 63% e il il tasso di sopravvivenza libera da tumore all'anno del gruppo di infusione del farmaco insensibile agli organoidi sarà del 40%, mentre quello unilaterale α=0,05, β=0,2, e il rapporto tra le dimensioni del campione dei due gruppi sarà 1 (gruppo sperimentale: gruppo di controllo ), in modo che le dimensioni del campione dei due gruppi saranno calcolate come 58 casi nel gruppo sperimentale, 58 casi nel gruppo di controllo e 11 casi nel gruppo di controllo, tenendo conto del 20% di perdita e una dimensione totale del campione di Saranno necessari 138 casi. 58 casi nel gruppo di controllo, per un totale di 116 casi, e considerando un calo del 20%, era necessaria una dimensione totale del campione di 146 casi.
3. Secondo i risultati della letteratura, il tasso di sopravvivenza libera da tumore a un anno del gruppo di controllo positivo è del 75% e, secondo il pre-test, il tasso di sopravvivenza libera da tumore a un anno del gruppo di infusione del farmaco sensibile agli organoidi gruppo dovrebbe essere del 73%, e il valore soglia di non inferiorità è 0,2 (gruppo di controllo-gruppo sperimentale), e il rapporto tra le dimensioni del campione dei due gruppi è uno con alfa unilaterale pari a 0,05 e beta pari a 0,2 , la dimensione del campione dei due gruppi è calcolata come 74 casi del gruppo con infusione di farmaci sensibili agli organoidi, 74 casi del gruppo di controllo positivo e un totale di 116 casi del gruppo sperimentale. 74 casi e 74 casi nel gruppo di controllo positivo, per un totale di 148 casi. Considerando un calo del 20%, la dimensione totale del campione richiesta è di 186 casi.
4. Secondo i risultati della letteratura, il tasso di sopravvivenza libera da tumore a tre anni del gruppo di controllo positivo è del 65% e, secondo il pre-test, il tasso di sopravvivenza libera da tumore a tre anni del gruppo di controllo positivo è pari al 65% e, secondo i risultati del pre-test, il tasso di sopravvivenza libera da tumore a tre anni del gruppo di controllo positivo è pari al 65% gruppo dovrebbe essere del 63%, e il valore soglia di non inferiorità è 0,2 (gruppo di controllo-gruppo test), e il rapporto tra le dimensioni del campione dei due gruppi è 1 se l'alfa unilaterale è 0,05 e il beta è 0,2, la dimensione del campione dei due gruppi è calcolata come 88 casi del gruppo di infusione di farmaci sensibili agli organoidi e 88 casi del gruppo di controllo positivo. 88 casi e 88 casi nel gruppo di controllo positivo, per un totale di 176 casi, e tenendo conto del 20% di perdita, era necessaria una dimensione totale del campione di 220 casi.

3.7 Diagramma di flusso delle tecniche di ricerca Questa sezione (immagini) descrive il percorso tecnico del progetto. 3.8 Raccolta e gestione dei dati I dati sono stati raccolti mediante osservazione e registrazione, e i dati originali sono stati controllati elemento per elemento per garantire che i dati fossero coerenti con quelli contenuti nei registri originali. Alla fine dell'esperimento, è stato consegnato allo statistico per l'analisi statistica.

3.9 Metodi di analisi statistica I dati misurati sono generalmente statistiche descrittive con valori medi, deviazione standard, mediana, minimo e massimo. Per le variabili categoriali, le statistiche descrittive verranno eseguite in base alla frequenza e alla percentuale.

Per l'analisi statistica è stato applicato il software statistico SPSS. I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard (x ± s), t-test, ANOVA a una via (test post hoc di confronto due a due utilizzando il metodo LSD), test chi-quadrato è stato utilizzato per il confronto dei tassi, e il metodo di Spearman è stato utilizzato per le analisi di correlazione. p < 0,05 è stato considerato una differenza statisticamente significativa.

3.10 Controllo di qualità 3.10.1 Classificazione della colorazione HE dell'organo e risultati immunoistochimici Conformi ai risultati del test patologico, indicando che i campioni organoidi e tumorali costruiti possono mantenere meglio la stabilità patologica.

3.10.2 Analisi WES o RNA-Seq di organoidi I campioni di organoidi e tumori costruiti possono mantenere meglio la stabilità genetica. 3.10.3 Criteri di valutazione per i risultati dei test di sensibilità ai farmaci Lo standard di valutazione dei risultati dei test di sensibilità ai farmaci ha IC50,IR come indice principale, con il grado di deviazione tra IC50 e la concentrazione del farmaco nel sangue, i risultati AUC come giudizio ausiliario, quando gli indici di sensibilità IC50,IR vengono soddisfatte contemporaneamente, è considerato sensibile; quando non è possibile soddisfare l'IC50, gli indici IR contemporaneamente, l'IC50 combinato con l'IC50 e la necessità di concentrare il rapporto del grado di differenza più piccolo nei risultati della sensibilità.

3.10.3.1 Criteri di valutazione IC50. IC50>20× Non sensibile

1×<IC50≤20× Bassa sensibilità 0,5×<IC50≤1× Moderatamente sensibile IC50≤0,5× altamente sensibile Il gruppo sensibile comprende fortemente sensibile e moderatamente sensibile, mentre il gruppo insensibile comprende debolmente sensibile e resistente.

3.10.3.2 Criteri di valutazione per il tasso di inibizione del tumore IR. IR <30% è insensibile e classificato come negativo; IR≥30% è sensibile e classificato come positivo, in cui 30%≤IR<50% è bassa sensibilità, 50%≤IR<70% è sensibilità moderata e IR≥70% è alta sensibilità.

Tasso di sensibilità = numero di casi con IR ≥ 30% / numero totale di casi nel gruppo.

3.10.3.3 Calcolo del grado di deviazione di IC50 dalla concentrazione ematica: il grado di deviazione dalla concentrazione ematica si riferisce al grado di differenza tra il valore IC50 ottenuto dal test di sensibilità al farmaco e la concentrazione ematica, ed è calcolato come IC50/concentrazione ematica.

Minore è il rapporto, più efficace è il farmaco. 3.10.3.4 Criteri per la valutazione dei risultati dell'AUC (area sotto la curva farmaco-tempo): il calcolo specifico dell'AUC solitamente comporta l'integrazione della curva concentrazione-tempo.

L’AUC è strettamente correlata alla relazione dose-risposta. Nella curva dose-risposta dell’efficacia del farmaco, l’AUC è un indicatore composito dell’effetto complessivo di un farmaco su un organismo tra dose e risposta. Un’AUC maggiore è solitamente associata a un migliore effetto terapeutico.

3.11 Trattamento post-studio degli organoidi Gli organoidi costruiti con successo in questo studio saranno uniformemente distrutti e smaltiti dopo lo studio in conformità con le norme sullo smaltimento dei rifiuti biomedici.