Protokół badawczy dotyczący oceny skuteczności perfundowanych środków chemioterapeutycznych w leczeniu raka pęcherza moczowego w oparciu o technologię organoidową

1. Tło Rak pęcherza moczowego jest nowotworem złośliwym wywodzącym się z nabłonka dróg moczowych pęcherza moczowego i zajmuje pierwsze miejsce pod względem częstości występowania nowotworów układu moczowo-płciowego w Chinach. Wśród nich najczęstszy jest rak nabłonkowy pęcherza moczowego, stanowiący ponad 90% nowotworów pęcherza moczowego. W zależności od głębokości naciekania nowotworu w pęcherzu i cech prognostycznych, klinicznie rak pęcherza moczowego dzieli się na nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego (NMIBC) i raka pęcherza moczowego inwazyjnego dla mięśni (MIBC), przy czym głównym typem raka jest NMIBC. około 75% wszystkich pacjentów z rakiem pęcherza moczowego.

   NMIBC leczy się zwykle metodą przezcewkowej resekcji guza pęcherza moczowego (TURBt). Pomimo początkowej fazy choroby, NMIBC charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem nawrotów, a badania wykazały, że w ciągu 5 lat odsetek nawrotów wynosi około 70%. Dlatego pooperacyjna chemioterapia perfuzyjna pęcherza stała się kluczowym środkiem terapeutycznym zapobiegającym nawrotom raka pęcherza moczowego. Od ponad 60 lat ludzie badają skuteczniejsze leki i metody perfuzyjne pęcherza. W 1961 r. Tiotepę zastosowano w terapii perfuzyjnej pęcherza moczowego i zyskała ona pewien stopień skuteczności w zapobieganiu nawrotom powierzchownych guzów pęcherza moczowego. W 1976 Morales uważał, że rak pęcherza moczowego jest związany z niedoborami odporności, w związku z czym terapia perfuzyjna pęcherza BCG okazała się niezwykle skuteczna, tworząc nowy sposób immunoterapii guzów pęcherza moczowego , który cieszy się dużym uznaniem i nadal jest uważany za najskuteczniejszy lek na perfuzję pęcherza moczowego. Jednakże zakroplenie BCG może powodować poważne skutki uboczne, w tym ziarniniaki cewki moczowej i prostaty, podrażnienie pęcherza, gorączkę, krwiomocz i inne objawy miejscowe oraz ogólnoustrojowe objawy grypopodobne, co może skutkować nietolerancją i przerwaniem leczenia u niektórych pacjentów, co ogranicza szerokie spektrum kliniczne. zastosowanie BCG. Badania wykazały, że dopęcherzowe wkroplenie środków chemioterapeutycznych do pęcherza moczowego może zmniejszyć częstość nawrotów krótkoterminowych powierzchownego raka pęcherza moczowego o około 15–20%, a częstość nawrotów długotrwałych o około 6%. Obecnie istnieje wiele możliwości wyboru środków chemioterapeutycznych do wkraplania do pęcherza moczowego, w tym (1) pirenzolubicyna; (2) gemcytabina; (3) mitomycyna; (4) epirubicyna; (5) doksorubicyna; (6) naprzemienna chemioterapia w postaci infuzji pęcherza moczowego z gemcytabiną i pirenzolubicyną; oraz (7) inne chemioterapie infuzyjne skojarzone. Jednak ze względu na dużą różnorodność leków chemioterapeutycznych dobór leków opiera się głównie na doświadczeniu klinicznym lub określonych wynikach badań, nie ma jednolitych standardów i jest ślepy, empiryczny i randomizowany. Chińskie wytyczne dotyczące diagnostyki i leczenia chorób urologicznych również nie przewidywały doboru leków perfuzyjnych, a poszczególni pacjenci na niektóre leki chemioterapeutyczne wykazują naturalną oporność, gdy klinika stwierdzi, że pacjent nie jest wrażliwy na stosowanie leku, lek wywołał poważne toksyczne skutki uboczne, a nawet doprowadzić do powstania zjawiska oporności wielolekowej (MDR), dzięki czemu kliniczny wskaźnik nawrotów nadal utrzymuje się na poziomie 36%-44%, a jednocześnie guz tej grupy chorych postępuje szybko, tracąc możliwość ponownego wyboru metody leczenia. Dlatego też, jak uniknąć selekcji leków pierwotnych opornych na leki i bezpośrednio wybrać leki o wysokiej czułości w celu uzyskania zindywidualizowanej chemioterapii, stało się gorącym tematem w badaniach nad chemioterapią perfuzji pęcherza.

   Realizacja precyzyjnej terapii nowotworów w dużym stopniu zależy od wykrycia wrażliwości na leki. Dzięki precyzyjnym, zindywidualizowanym eksperymentom przesiewowym leków chemioterapeutycznych, przed rozpoczęciem leczenia można ocenić najskuteczniejszy i najmniej toksyczny schemat terapeutyczny dla każdego pacjenta, tak aby zaproponowanie schematu chemioterapii dla pojedynczego pacjenta stanowiło nowy kierunek badań umożliwiający osiągnięcie precyzyjnego leczenia raka pęcherza moczowego i poprawy skuteczności chemioterapii raka pęcherza moczowego. Wcześniej częściej stosowanymi modelami przedklinicznym były tradycyjne linie komórek nowotworowych i ksenoprzeszczepy tkanki nowotworowej pochodzenia ludzkiego (PDX). Metoda hodowli linii komórek nowotworowych jest prosta, ale niewystarczająca do symulacji stanu wzrostu komórek nowotworowych u pacjentów, a leki badane przesiewowo w ramach tego systemu badań przesiewowych leków mają niską wartość w zastosowaniu klinicznym. PDX, chociaż może symulować charakterystykę nowotworu in vivo i chronić guz mikrośrodowisku, ma oczywiste ograniczenia, takie jak niska stabilna rakotwórczość, długi okres modelowania i oceny (od pół roku do jednego roku), jest czasochłonne i pracochłonne, a także jest trudne do wygenerowania i wykorzystania do wysokowydajnych badań przesiewowych leków. Dlatego też konieczne stało się opracowanie modeli testów wrażliwości na leki, które mogłyby naśladować heterogeniczność i złożoność raka pęcherza moczowego, aby opracować bardziej spersonalizowane strategie terapeutyczne i zapobiegawcze minimalizujące ryzyko i optymalizujące skuteczność interwencji medycznych poprzez ukierunkowanie na unikalne czynniki genetyczne, środowiskowe i styl życia poszczególnych osób.

   Organoidy pochodzące od pacjenta (PDO) to trójwymiarowe struktury organoidalne utworzone przez komórki macierzyste samoorganizujące się in vitro, które można różnicować na wiele typów komórek specyficznych dla narządu i które mogą wykazywać interakcje komórka-komórka i macierz otaczająca komórkę oraz wzorce lokalizacji przestrzennej, odtwarzając in vitro niektóre z kluczowych funkcji i struktur rzeczywistych narządów oraz posiadające stabilny fenotyp. struktury o stabilnych cechach fenotypowych i genetycznych. W porównaniu z dwuwymiarowymi liniami komórkowymi nowotworów i PDX, organoidy nowotworowe można hodować bezpośrednio przy użyciu własnych tkanek pacjenta, a jednocześnie organoidy te mogą dobrze replikować niektóre kluczowe cechy guzów pierwotnych, zachowując patomorfologię i mechanizmy biologiczne tkanek pacjenta, zachowując heterogeniczność tkanek nowotworowych i bardziej realistyczne mikrośrodowisko nowotworu, a także charakteryzując się krótkim cyklem wzrostu. Jest pomocny w stosowaniu u klinicznych pacjentów z nowotworem do badania wrażliwości leków do radioterapii, leków celowanych molekularnie, przeciwciał przeciwnowotworowych i innych leków, aby przewidzieć reakcję pacjenta na leki, co może pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia klinicznego.

   W 2018 r. firma Science zgłosiła badanie dotyczące wykorzystania przerzutowych narządów guzopodobnych przewodu pokarmowego do badania wrażliwości na leki, w ramach którego porównano różnice we wrażliwości między 21 pacjentami klinicznymi i odpowiadającymi im PDO na serię leków celowanych i chemioterapeutycznych, a wyniki wykazały silna spójność między nimi. W porównaniu z rzeczywistymi wynikami pacjentów, PDO były dobrze przewidywane (czułość 100%, swoistość 93%, dodatnia wartość predykcyjna 88% i ujemna wartość predykcyjna 100%).20 W 2020 roku Yao Y i wsp. skonstruowali 96 organoidów raka odbytnicy przy użyciu biopsji ze 112 przypadków miejscowo zaawansowanego raka odbytnicy i wybrali 80 z nich w celu sprawdzenia ich odpowiedzi na radioterapię, a wyniki wykazały, że organoidy raka odbytnicy były wrażliwe na radioterapię i zdolność pacjenta do odpowiedź kliniczna. Wyniki wykazały, że wrażliwość organoidów raka odbytnicy na radioterapię była w dużym stopniu zgodna z odpowiedzią kliniczną pacjentów (czułość 78%, swoistość 92%, dokładność 84%). Następnie w przypadku nowotworów takich jak rak żołądka i rak piersi stwierdzono również zgodność między PDO a reakcją pacjentów z nowotworem na leki. Yan HHN i wsp. skonstruowali bibliotekę organoidów raka żołądka, wykorzystując tkanki nowotworowe, tkanki paranowotworowe i przerzuty do węzłów chłonnych od 34 pacjentów z rakiem żołądka. U dwóch z nich wystąpiły przerzuty nowotworu i po operacji przeszli leczenie skojarzone cisplatyną i 5-FU, przy czym w obu przypadkach uzyskano dobrą odpowiedź. Drugi przypadek otrzymał chemioterapię przed operacją i nie reagował na kapecytabinę po operacji. Badanie wrażliwości odpowiednich związków PDO w tych trzech przypadkach wykazało, że wrażliwość PDO na lek była w doskonałej zgodzie z odpowiedzią kliniczną każdego pacjenta. Guillen KP i wsp. skonstruowali PDX i PDO przy użyciu próbek nowotworów pochodzących z opornych na terapię hormonalną, pacjentów z nawrotowym i przerzutowym rakiem piersi, a próbki te zbadano pod kątem histomorfologicznym, genomicznym i wrażliwości na lek. Wyniki wykazały, że zarówno PDX, jak i PDO raka piersi w dużym stopniu redukowały właściwości histobiologiczne i genomiczne nowotworów źródłowych i oba konsekwentnie reagowały na leki przeciwnowotworowe. W niniejszym badaniu u pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi w stopniu IIA wystąpiły przerzuty do wątroby po około roku od przedoperacyjnej chemioterapii i leczenia chirurgicznego. Badacze poddali konstrukty PDO i PDX testowi wrażliwości na leki ex vivo i odkryli, że najlepszy efekt terapeutyczny ma inhibitor mikrotubul erybulina. Na podstawie tego wyniku zalecono pacjentom leczenie erybuliną, w wyniku którego uzyskano całkowitą remisję przerzutów do wątroby przez prawie 5 miesięcy po podaniu leku. Badania te potwierdzają w pewnym stopniu możliwość PDO w leczeniu pacjentów z nowotworami klinicznymi. Wykazano również, że porównując różnicę w odpowiedzi na leki pomiędzy narządami prawidłowymi a PDO, stwierdzono, że leki o wysokiej selektywności pomagają zmniejszyć toksyczne skutki uboczne u pacjentów klinicznych. Zatem jasne jest, że badanie wrażliwości na leki prowadzone przez PDO w celu znalezienia najodpowiedniejszego schematu leczenia pomoże poprawić skuteczność kliniczną pacjentów z nowotworami, zmniejszyć toksyczne skutki uboczne, ryzyko lekooporności i ryzyko nawrotu nowotworu, a także zmaksymalizować korzyści dla pacjentów. pacjenci.

   Dlatego też, opierając się na modelach organoidowych raka pęcherza moczowego pochodzących od pacjenta, przeprowadzimy eksperymenty polegające na badaniu wrażliwości na leki w przypadku nieinwazyjnej dla mięśnia mięśniowego raka pęcherza moczowego, chemioterapii perfuzyjnej, ustanowimy ustandaryzowany system badania wrażliwości na leki dla organoidów raka pęcherza moczowego i sformułowamy standardy badań przesiewowych w zakresie badania wrażliwości na leki organoidów raka pęcherza moczowego, aby dokonać przeglądu optymalnego schematu skojarzenia leków, pomóc w opracowaniu klinicznym nowych zindywidualizowanych protokołów leczenia i przeprowadzić wieloośrodkową walidację kliniczną w celu osiągnięcia prawdziwego „testowania leku zastępczego”.

2. Pytania i cele badawcze Pytania badawcze: W badaniu tym porównano współczynnik przeżycia jednego roku bez nawrotu nowotworu i wskaźnik przeżycia trzech lat bez nawrotu nowotworu u pacjentów w grupie otrzymującej wlew leku wrażliwego na organoidy, grupie otrzymującej wlew leku niewrażliwego na organoidy, i grupę otrzymującą wlew BCG za pomocą badania kohortowego, a różnicę w częstości nawrotów pomiędzy trzema grupami porównuje się za pomocą jednoczynnikowej analizy przeżycia K-M. Ocena mająca na celu ocenę wartości testów wrażliwości na leki narządów guzopodobnych w prowadzeniu indywidualnej chemioterapii perfuzyjnej w przypadku raka pęcherza moczowego.

   Cel badawczy: ocena przydatności eksperymentów dotyczących wrażliwości na leki na narządy guzopodobne w prowadzeniu indywidualnej chemioterapii perfuzyjnej w przypadku raka pęcherza moczowego poprzez obserwację skuteczności klinicznej metody wrażliwości na leki na narządy guzopodobne w prowadzeniu pooperacyjnej chemioterapii perfuzyjnej u pacjentów z rakiem pęcherza moczowego.

   Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Miary wyników

3. Metodologia badania 3.1 Projekt badania Niniejszy protokół opiera się na Wytycznych technicznych dotyczących badań klinicznych leków przeciwnowotworowych i obejmuje wieloośrodkowe badanie kohortowe.

3.1.1 Grupowanie Szczegóły opisano w sekcji Grupy i interwencje 3.1.2 Preparat organoidowy raka pęcherza moczowego

1. Pobieranie próbek raka pęcherza moczowego Proces pobierania próbek odbywa się zgodnie z etyką szpitala i podpisaną świadomą zgodą. Pacjenci włączeni do eksperymentu muszą mieć patologicznie zdiagnozowanego raka pęcherza moczowego, a wielkość próbek nowotworu pobranych operacyjnie powinna w miarę możliwości być większa niż 0,8 cm*3 w celu weryfikacji patologicznej, hodowli organoidów, testu wrażliwości na leki itp. Tkanki nowotworowe należy pobierać zwracając uwagę na czas niedokrwienia tkanek i kriokonserwację, a czas pobrania nie powinien przekraczać 5 minut po usunięciu tkanek z krążenia ludzkiego, aby uniknąć martwicy stresowej tkanek nowotworowych na skutek wczesnego niedotlenienia.
2. Przygotowanie narządu raka pęcherza moczowego W procesie przetwarzania tkanek do obróbki próbek tkanek stosowano fizyczne kruszenie i trawienie kolagenazą, a przetworzone i strawione organoidy przed hodowlą należało przefiltrować przez sita komórkowe o różnych średnicach, aby otrzymać otrzymane organoidy jednolitych rozmiarów i ułatwiają ujednolicenie standardów. Następnie zasadzono je w trójwymiarowym żelu matrixowym i hodowano w specjalnym podłożu.
3. Ekspansja i hodowla organoidów raka pęcherza moczowego Stan wzrostu organoidów obserwowano mikroskopowo, a do scharakteryzowania organoidów, potwierdzenia obecności komórek nowotworowych i oceny ich morfologii wykorzystano badania immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne. Narządy rakowiaka raka pęcherza pasażowano i zamrażano.

3.1.3 Badanie wrażliwości organoidów na lek, nowotwór pęcherza moczowego. Po zaobserwowaniu pod mikroskopem liczby organoidów, która osiągnęła liczbę, którą można poddać testowi wrażliwości na lek, pożywkę organoidową odessano i odrzucono. Dodać 3 mL roztworu trawiennego na szalkę Petriego, rozdmuchać kropelki, rozpuścić w temperaturze 37°C, przedmuchać organoidy i obserwować pod mikroskopem, kiedy organoidy zostaną strawione do jednorodnej masy komórkowej zawierającej 2-3 komórki, dodać 2-krotność objętość roztworu trawiennego, aby zakończyć trawienie. 1500 obr/min, wiruj komórki przez 3 minuty, a następnie odessaj i odrzuć supernatant.

Zawiesić komórki w pożywce, starając się nie wytwarzać pęcherzyków powietrza i rozcieńczyć pożywkę do żelu w stosunku 1:1,5, następnie zaszczepić zmieszany żel w ilości 10 µl/studzienkę za pomocą pipety jednokanałowej do wstępnie schłodzonych 384-dołkowych płytek zawierających 3000 organoidów na dołek (operację tę przeprowadzono na lodzie). Po zmieszaniu pożywki z gumą w stosunku 1:1 (40 µl:40 µl), pożywkę dozowano do płytki z 384 dołkami w ilości 10 µl/dołek jako grupę ślepą. Po delikatnym opukaniu płytki z 384 dołkami tak, aby kropelki żelu leżały płasko na dnie dołków, płytkę umieszczono w inkubatorze na 30 minut, aby umożliwić zestalinie się kropelek żelu i dodano wstępnie ogrzaną pożywkę BCOs w ilości 40 µl /Dobrze. Do dołków do testów narkotykowych, jak również do pustych dołków wokół dołków kontrolnych, dodano 40 µl roztworu PBS i umieszczono w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, aby zapobiec odparowaniu cieczy i wysuszeniu kropli żelu.

Po 3 dniach inkubacji i obserwacji przeprowadzono obserwację mikroskopową stanu próbki w każdym dołku pod kątem wymiany płynu w połowie objętości.

Zaprojektuj protokół testu wrażliwości na lek zgodnie z wymaganiami poniższej tabeli, ustaw grupę kontrolną, grupę ślepą i grupę testową na obecność leku, lek rozpuszczono zgodnie z instrukcją i rozcieńczono odpowiednio 4-krotnie do 6 stężeń w pożywce organoidowej; za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych, lek badano przy różnych stężeniach, stężeniu półinhibicyjnym (IC50), hamowaniu komórek nowotworowych (IR), stopniu odchylenia IC50 od stężenia leku we krwi, AUC (pole pod dawką -krzywa odpowiedzi), kryteria oceny wyników testu wrażliwości na lek przyjmują jako główne wskaźniki IC50 i IR, a także stopień odchylenia IC50 od stężenia leku we krwi oraz wyniki AUC jako ocenę pomocniczą (szczegóły podano w pkt. proszę odnieść się do 3.10.3), ocena wpływu na przeżycie i proliferację danej klasy organizmów oraz przedstawienie wskazówek klinicznych dotyczących stosowania leku.

Tabela 1 Metody grupowania testów wrażliwości na leki Metoda grupowania testów wrażliwości na leki Grupa pusta: Bez organoidu, bez dodatku leku, 6 powtórzeń dołków na płytkę. Grupa kontrolna: Zaszczepiona organoidami, bez ekspozycji na dodatkowy lek. Grupa testowana na obecność narkotyków: Zaszczepiono organoid, dodać ekspozycję na lek. 3.1.4 Schematy skojarzone chemioterapii Tabela 2 Leki do chemioterapii perfuzyjnej Gemcytabina □ Pirorubicyna □ Epirubicyna □ Silvestrol □ Adriamycyna (doksorubicyna) □ 3.2 Ośrodek badania i populacja badania (źródło i kryteria wykluczenia włączenia) Szczegóły znajdują się w projekcie badania 3.3 Zmienne badania (czynniki) i pomiary Wynik pozytywny grupa kontrolna nie była poddawana hodowli organoidów ani testom wrażliwości na leki.

Pozostali pacjenci zostali poddani badaniu wrażliwości organoidów na lek zgodnie z protokołem badania wrażliwości na leki, przy użyciu testu żywotności komórek luminescencyjnych w celu sprawdzenia stężenia półinhibicyjnego (IC50) leku, szybkości hamowania (IR) komórek nowotworowych, stopnia odchylenia IC50 od stężenia leku we krwi oraz AUC (obszaru pod krzywą dawka-odpowiedź) przy różnych stężeniach, a kryteria oceny wyników testów wrażliwości na leki oparto na IC50,IR jako głównych wskaźnikach przy odchyleniu IC50 od stężenia leku we krwi, wyniki AUC stanowią ocenę pomocniczą (patrz 3.10.3 aby poznać szczegóły), aby ocenić jego wpływ na przeżycie i proliferację narządów klasowych.

Zgodnie z doświadczeniem klinicystów, pacjentom, u których wykonano posiew organoidów i badanie wrażliwości na leki, wstrzyknięto do pęcherza moczowego środki chemioterapeutyczne. Pięć perfundowanych leków obejmowało gemcytabinę, piroksykam, epirubicynę, mitomycynę i adriamycynę (doksorubicynę). W zależności od wrażliwości leków perfuzyjnych w teście wrażliwości na leki organoidowe, podzielono je na grupę perfuzyjną leków wrażliwych na organoidy i grupę perfuzyjną leków niewrażliwych na organoidy. Schemat perfuzyjny: obejmujący indukcyjną chemioterapię perfuzyjną (4-8 tygodni po operacji, 1 raz w tygodniu, w sumie 4 razy) i podtrzymującą chemioterapię perfuzyjną (1 raz w miesiącu, łącznie 11 razy).

Schemat infuzji BCG: 6 infuzji indukcyjnych, następnie 3 infuzje przypominające raz na 2 tygodnie w celu utrzymania dobrej odpowiedzi immunologicznej, a następnie 10 infuzji podtrzymujących raz w miesiącu, łącznie 19 infuzji w ciągu 1 roku.

Pomiary kliniczne: dwie grupy pacjentów z grupy perfuzji leku wrażliwej na organoidy i grupy perfuzji leku niewrażliwej na organoidy obserwowano i analizowano pod kątem pierwszorzędowych i drugorzędowych punktów końcowych badania, a także przeprowadzono jednoczynnikową analizę przeżycia Kaplana-Meiera aby porównać różnice w częstości nawrotów pomiędzy obiema grupami. Do analizy współczynnika ryzyka nawrotu w obu grupach pacjentów wykorzystano model proporcji ryzyka COX w zależności od płci, wieku, stopnia zaawansowania nowotworu i jego stopnia zaawansowania.

3.4 Wyniki badania Do oceny skuteczności zastosowano kryteria RECIST1.1, a kryteria Choi i mRECIST wykorzystano jako pomocnicze kryteria oceny skuteczności.

Pierwszorzędowe punkty końcowe badania: roczny wskaźnik przeżycia bez nawrotu nowotworu, 3-letni współczynnik przeżycia bez nawrotu nowotworu.

Drugorzędowe punkty końcowe: roczny wskaźnik przeżycia wolnego od progresji nowotworu, 3-letni współczynnik przeżycia wolnego od progresji nowotworu.

3.5 Obserwacja Dwie grupy pacjentów z grupy, której poddano perfuzję leku wrażliwego na narządy i grupy pacjentów z perfuzją leku niewrażliwego na narządy, były monitorowane i analizowane pod kątem pierwszorzędowych i drugorzędowych punktów końcowych badania.

Cystoskopia jest metodą z wyboru w ocenie pacjentów z NMIBC i nie ma nieinwazyjnej alternatywy dla cystoskopii. Dlatego kontrola NMIBC powinna opierać się na regularnej cystoskopii. Jeżeli w trakcie badania zostaną wykryte podejrzane zmiany na błonie śluzowej pęcherza moczowego, należy wykonać biopsję w celu wyjaśnienia zmian patologicznych. W razie potrzeby wykonuje się cytologię złuszczającą moczu, CT/CTU lub MRI/MRU, ale żadna z nich nie może całkowicie zastąpić cystoskopii.

Plan przeglądu cystoskopii: NMIBC niskiego ryzyka wykonuje się raz po 3 miesiącach i 12 miesiącach po operacji w pierwszym roku, a następnie raz w roku aż do trzeciego roku; NMIBC średniego ryzyka wykonuje się raz na 3, 6 i 12 miesięcy po operacji, co 6 miesięcy w drugim roku, a następnie co rok aż do trzeciego roku; NMIBC wysokiego ryzyka wykonuje się co 3 miesiące przez pierwsze 2 lata, a następnie co 6 miesięcy aż do 3 roku.

3.6 Wielkość próby Wielkość próby wynosząca 293 przypadki była wystarczająca, aby spełnić wymagania dotyczące punktów końcowych badania.

Było 73 przypadki w grupie perfuzji leku niewrażliwej na organoidy i po 110 przypadków w grupie perfuzji leku wrażliwej na organoidy i grupie kontroli pozytywnej.

Podstawa obliczeń:

1. Obliczanie wielkości próby dla punktu końcowego badania rocznego przeżycia wolnego od guza: oczekuje się, że roczny wskaźnik przeżycia wolnego od guza wyniesie 73% w grupie otrzymującej wlew leku wrażliwego na organoidy i 50% w grupie niewrażliwej na organoidy grupa wlewu leku, z jednostronnym α=0,05, β=0,2, a stosunek wielkości próbek w obu grupach wynosi 1 (grupa eksperymentalna: grupa kontrolna), liczebność próbek w obu grupach wynosi 55 przypadków w grupie eksperymentalnej, 55 przypadków w grupie kontrolnej i 110 przypadków w grupie kontroli pozytywnej. 55 przypadków w grupie kontrolnej, łącznie 110 przypadków i biorąc pod uwagę 20% wydalania, wymagana jest całkowita wielkość próby wynosząca 138 przypadków.
2. Obliczyć wielkość próby zgodnie z punktem końcowym trzyletniego badania współczynnika przeżycia wolnego od guza: oczekuje się, że wskaźnik trzyletniego przeżycia wolnego od guza w grupie, której podano infuzję leku wrażliwego na organoidy, wyniesie 63%, a roczny wskaźnik przeżycia wolnego od nowotworu w grupie, której podano wlew leku niewrażliwego na organoidy, wyniesie 40%, a jednostronny α=0,05, β=0,2, a stosunek wielkości próbek w obu grupach będzie wynosić 1 (grupa eksperymentalna: grupa kontrolna ), tak że liczebność próbek w obu grupach zostanie obliczona jako 58 przypadków w grupie eksperymentalnej, 58 przypadków w grupie kontrolnej i 11 przypadków w grupie kontrolnej, biorąc pod uwagę 20% wydalania i całkowitą wielkość próby wynoszącą Wymaganych będzie 138 przypadków. W grupie kontrolnej było 58 przypadków, w sumie 116 przypadków i biorąc pod uwagę 20% wydalanie, wymagana była całkowita wielkość próby wynosząca 146 przypadków.
3. Według wyników literatury, roczny wskaźnik przeżycia bez guza w grupie kontroli pozytywnej wynosi 75%, a według testu wstępnego, roczny wskaźnik przeżycia bez guza po wlewie leku wrażliwego na organoidy oczekuje się, że grupa ta będzie wynosić 73%, a wartość odcięcia równoważności wynosi 0,2 (grupa kontrolna-grupa eksperymentalna), a stosunek wielkości próbek w obu grupach wynosi jeden, przy czym jednostronna alfa wynosi 0,05, a beta wynosi 0,2 wielkość próby obu grup obliczono jako 74 przypadki w grupie otrzymującej wlew leku wrażliwego na organoidy, 74 przypadki w grupie kontroli pozytywnej i łącznie 116 przypadków w grupie eksperymentalnej. 74 przypadki i 74 przypadki w grupie kontroli pozytywnej, w sumie 148 przypadków. Biorąc pod uwagę 20% wydalanie, całkowita wymagana wielkość próbki wynosi 186 przypadków.
4. Zgodnie z wynikami literatury, wskaźnik trzyletniego przeżycia bez guza w grupie kontroli pozytywnej wynosi 65%, a według testu wstępnego wskaźnik trzyletniego przeżycia bez guza po wlewie leku wrażliwego na organoidy oczekuje się, że grupa ta będzie wynosić 63%, a wartość odcięcia równoważności wynosi 0,2 (grupa kontrolna-grupa testowa), a stosunek wielkości próbek w obu grupach wynosi 1, jeśli jednostronna alfa wynosi 0,05, a beta wynosi 0,2, wielkość próby w obu grupach oblicza się jako 88 przypadków w grupie otrzymującej wlew leku wrażliwego na organoidy i 88 przypadków w grupie kontroli pozytywnej. 88 przypadków i 88 przypadków w grupie kontroli pozytywnej, łącznie 176 przypadków i biorąc pod uwagę 20% wydalanie, wymagana była całkowita wielkość próby wynosząca 220 przypadków.

3.7 Schemat blokowy technik badawczych Ta sekcja (zdjęcia) opisuje techniczną ścieżkę projektu. 3.8 Zbieranie danych i zarządzanie nimi Dane zbierano poprzez obserwację i rejestrację, a oryginalne dane sprawdzono element po elemencie, aby upewnić się, że są zgodne z danymi w oryginalnych zapisach. Po zakończeniu eksperymentu przekazano go statystykowi do analizy statystycznej.

3.9 Metody analizy statystycznej Zmierzone dane są ogólnie statystykami opisowymi ze średnią, odchyleniem standardowym, medianą, wartością minimalną i maksymalną. W przypadku zmiennych kategorycznych statystyki opisowe zostaną przeprowadzone według częstotliwości i wartości procentowej.

Do analizy statystycznej wykorzystano program statystyczny SPSS. Dane pomiarowe wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (x ± s), test t, jednokierunkową ANOVA (test post hoc porównań dwa na dwa przy użyciu metody LSD), do porównania współczynników zastosowano test chi-kwadrat, a do analiz korelacji wykorzystano metodę Spearmana. Za istotną statystycznie różnicę uznano p < 0,05.

3.10 Kontrola jakości 3.10.1 Klasa wyników barwienia narządów HE i wyników immunohistochemii Zgodność z wynikami testów patologicznych, wskazującymi, że skonstruowane próbki organoidów i nowotworów mogą lepiej zachować stabilność patologiczną.

3.10.2 Analiza organoidów WES lub RNA-Seq Skonstruowane próbki organoidów i nowotworów mogą lepiej zachować stabilność genetyczną. 3.10.3 Kryteria oceny wyników testów wrażliwości na leki Standard oceny wyników testów wrażliwości na leki przyjmuje jako główny wskaźnik IC50,IR, ze stopniem odchylenia pomiędzy IC50 a stężeniem leku we krwi, wyniki AUC jako ocenę pomocniczą, gdy wskaźniki wrażliwe na IC50, IR są spełnione jednocześnie, uznaje się je za wrażliwe; gdy nie jest możliwe jednoczesne spełnienie wskaźników IC50, IR, IC50 w połączeniu z IC50 i potrzeba koncentracji współczynnika mniejszego stopnia różnicy w wynikach czułości.

3.10.3.1 Kryteria oceny IC50. IC50>20× Brak czułości

1×<IC50≤20× Niska czułość 0,5×<IC50≤1× Umiarkowanie czuła IC50≤0,5× wysoce wrażliwe Do grupy wrażliwej zalicza się silnie wrażliwe i średnio wrażliwe, a do grupy niewrażliwej zalicza się słabo wrażliwe i odporne.

3.10.3.2 Kryteria oceny stopnia hamowania nowotworu IR. IR <30% jest nieczułe i klasyfikowane jako ujemne; IR≥30% jest czułe i klasyfikowane jako dodatnie, gdzie 30%≤IR<50% to niska czułość, 50%≤IR<70% to umiarkowana czułość, a IR≥70% to wysoka czułość.

Wskaźnik czułości = liczba przypadków z IR ≥ 30% / całkowita liczba przypadków w grupie.

3.10.3.3 Obliczanie stopnia odchylenia IC50 od stężenia we krwi: stopień odchylenia od stężenia we krwi odnosi się do stopnia różnicy pomiędzy wartością IC50 uzyskaną z testu wrażliwości na lek a stężeniem we krwi i jest obliczany jako IC50/stężenie we krwi.

Im mniejszy stosunek, tym skuteczniejszy lek. 3.10.3.4 Kryteria oceny wyników AUC (pole pod krzywą leku w czasie): Specyficzne obliczenie AUC zwykle obejmuje całkowanie krzywej stężenie-czas.

AUC jest ściśle powiązane z zależnością dawka-odpowiedź. Na krzywej skuteczności leku w zależności od dawki AUC jest złożonym wskaźnikiem całkowitego wpływu leku na organizm pomiędzy dawką a odpowiedzią. Większe AUC zwykle wiąże się z lepszym efektem terapeutycznym.

3.11 Obróbka organoidów po zakończeniu badania Organoidy skonstruowane pomyślnie w tym badaniu zostaną równomiernie zniszczone i usunięte po badaniu zgodnie z normami usuwania odpadów biomedycznych.