Ein Forschungsprotokoll zur Bewertung der Wirksamkeit perfundierter Chemotherapeutika bei Blasenkrebs basierend auf Organoid-Technologie

1. Hintergrund Blasenkrebs ist ein bösartiger Tumor, der aus dem Uroepithel der Blase stammt und in China den ersten Platz bei der Inzidenz von Urogenitaltumoren einnimmt. Unter ihnen ist Blasen-Uroepithelkarzinom am häufigsten und macht mehr als 90 % aller Blasenkrebserkrankungen aus. Abhängig von der Tiefe der Tumorinvasion in die Blase und den prognostischen Merkmalen wird Blasenkrebs klinisch in nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC) und muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC) eingeteilt, wobei NMIBC der Haupttyp ist etwa 75 % aller Blasenkrebspatienten.

   NMIBC wird normalerweise mit der transurethralen Resektion eines Blasentumors (TURBt) behandelt. Obwohl sich NMIBC im Frühstadium der Erkrankung befindet, weist es eine hohe Rezidivrate auf. Studien berichten von einer 5-Jahres-Rezidivrate von etwa 70 %. Daher ist die postoperative Blasenperfusionschemotherapie zu einer wichtigen therapeutischen Maßnahme geworden, um das Wiederauftreten von Blasenkrebs zu verhindern. Seit mehr als 60 Jahren wird nach wirksameren Medikamenten und Methoden für die Blasenperfusion gesucht. Im Jahr 1961 wurde Thiotepa für die Blasenperfusionstherapie eingesetzt und gewann an Bedeutung ein gewisses Maß an Wirksamkeit bei der Verhinderung des Wiederauftretens von oberflächlichen Tumoren der Blase. 1976 glaubte Morales, dass Blasenkrebs mit Immunschwächen zusammenhängt, und dementsprechend war die BCG-Blasenperfusionstherapie äußerst erfolgreich und schuf eine neue Art der Immuntherapie für Blasentumoren , das weithin geschätzt wird und immer noch als das wirksamste Medikament zur Blasenperfusion gilt. Allerdings kann die BCG-Instillation schwerwiegende Nebenwirkungen haben, einschließlich Harnröhren- und Prostatagranulomen, Blasenreizung, Fieber, Hämaturie und anderen lokalen Manifestationen sowie systemischen grippeähnlichen Symptomen, die bei einigen Patienten zu Unverträglichkeiten und Behandlungsunterbrechungen führen, was die breite klinische Palette eingeschränkt hat Anwendung von BCG. Studien haben gezeigt, dass die intravesikale Instillation von Chemotherapeutika in die Blase die kurzfristige Rezidivrate von oberflächlichem Blasenkrebs um etwa 15–20 % und die langfristige Rezidivrate um etwa 6 % senken kann. Derzeit gibt es eine große Auswahl an Chemotherapeutika zur Blaseninstillation, darunter (1) Pirenzolubicin; (2) Gemcitabin; (3) Mitomycin; (4) Epirubicin; (5) Doxorubicin; (6) abwechselnde Blaseninfusionschemotherapie mit Gemcitabin und Pirenzolubicin; und (7) andere kombinierte Infusionschemotherapien. Aufgrund der großen Vielfalt an Chemotherapeutika beruht die Medikamentenauswahl jedoch meist auf klinischen Erfahrungen oder bestimmten Forschungsergebnissen, es gibt keinen einheitlichen Standard und sie erfolgt blind, empirisch und randomisiert. Die chinesischen Diagnose- und Behandlungsrichtlinien für urologische Erkrankungen sahen auch keine Auswahl von Perfusionsmedikamenten vor, und einzelne Patienten zeigen bei einigen Chemotherapeutika eine natürliche Resistenz. Wenn die Klinik feststellt, dass der Patient nicht empfindlich auf die Anwendung des Arzneimittels reagiert, hat das Arzneimittel schwerwiegende Folgen toxische Nebenwirkungen und führen sogar zum Phänomen der Multiresistenz (Multi-Drug-Resistenz, MDR), so dass die klinische Rezidivrate immer noch bei 36–44 % liegt und gleichzeitig die Der Tumor dieser Patientengruppe schreitet schnell voran und verliert die Möglichkeit, die Behandlungsmethode erneut zu wählen. Daher ist die Frage, wie die Auswahl primär arzneimittelresistenter Arzneimittel vermieden und Arzneimittel mit hoher Empfindlichkeit direkt ausgewählt werden können, um eine individualisierte Chemotherapie zu erreichen, zu einem Brennpunkt in der Forschung zur Blasenperfusionschemotherapie geworden.

   Die Verwirklichung einer präzisen Tumortherapie hängt in hohem Maße von der Erkennung der Arzneimittelsensitivität ab. Durch präzise individualisierte Chemotherapeutika-Screening-Experimente kann für jeden Patienten vor Beginn der Behandlung das wirksamste und am wenigsten toxische Therapieschema beurteilt werden. Das Vorschlagen eines Chemotherapieschemas für einen einzelnen Patienten ist eine neue Forschungsrichtung zur Verwirklichung einer Präzisionsbehandlung von Blasenkrebs und zur Verbesserung der Effizienz der Chemotherapie bei Blasenkrebs. Bisher waren die am häufigsten verwendeten präklinischen Modelle traditionelle Tumorzelllinien und vom Menschen stammende Tumorgewebe-Xenotransplantate (PDX). Die Methode der Tumorzelllinienkultur ist einfach, reicht aber nicht aus, um den Wachstumszustand von Tumorzellen bei Patienten zu simulieren, und die von ihrem Arzneimittelscreening-System gescreenten Arzneimittel sind für die klinische Anwendung von geringem Wert. PDX kann zwar Tumoreigenschaften in vivo simulieren und den Tumor erhalten Mikroumgebung weist offensichtliche Einschränkungen auf, wie z. B. eine geringe stabile Tumorigenität, einen langen Modellierungs- und Bewertungszeitraum (ein halbes bis ein Jahr), ist zeitaufwändig und mühsam und es ist schwierig, sie für das Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz zu erstellen und zu verwenden. Daher ist die Entwicklung von Medikamentensensitivitätstestmodellen notwendig geworden, die die Heterogenität und Komplexität von Blasenkrebs nachahmen können, um personalisiertere therapeutische und präventive Strategien zu entwickeln, um das Risiko zu minimieren und die Wirksamkeit medizinischer Interventionen zu optimieren, indem sie auf die einzigartige genetische Umwelt abzielen und Lebensstilmerkmale von Einzelpersonen.

   Von Patienten abgeleitete Organoide (PDO) sind 3D-Organoidstrukturen, die durch in vitro Selbstorganisation von Stammzellen gebildet werden, die in mehrere organspezifische Zelltypen differenziert werden können und Zell-Zell- und Zell-umgebende Matrix-Wechselwirkungen sowie räumliche Standortmuster aufweisen können, die sich nachbilden in vitro einige der Schlüsselfunktionen und Strukturen realer Organe und einen stabilen Phänotyp. Strukturen mit stabilen phänotypischen und genetischen Eigenschaften. Im Vergleich zu zweidimensionalen Tumorzelllinien und PDX können Tumororganoide direkt unter Verwendung des eigenen Gewebes des Patienten kultiviert werden. Gleichzeitig können diese Organoide einige der Schlüsselmerkmale der Primärtumoren gut reproduzieren und die Pathomorphologie und biologischen Mechanismen beibehalten des Gewebes des Patienten und bewahren die Heterogenität des Tumorgewebes und eine realistischere Tumormikroumgebung sowie einen kurzen Wachstumszyklus. Es ist hilfreich für den Einsatz bei klinischen Krebspatienten zum Testen der Arzneimittelsensitivität von Strahlentherapie-Arzneimitteln, molekularen Targeting-Arzneimitteln, Antitumor-Antikörpern und anderen Arzneimitteln, um die Reaktion des Patienten auf Arzneimittel vorherzusagen und möglicherweise bei klinischen Behandlungsentscheidungen zu helfen.

   Im Jahr 2018 berichtete Science über eine Studie über die Verwendung metastasierter gastrointestinaler tumorähnlicher Organe für Arzneimittelsensitivitätstests, in der die Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen 21 klinischen Patienten und ihren entsprechenden PDOs gegenüber einer Reihe gezielter und chemotherapeutischer Arzneimittel vergleichend analysiert wurden, und die Ergebnisse zeigten starke Übereinstimmung zwischen den beiden. Im Vergleich zu den tatsächlichen Patientenergebnissen wurden die PDOs gut vorhergesagt (Sensitivität 100 %, Spezifität 93 %, positiver Vorhersagewert 88 % und negativer Vorhersagewert 100 %).20 Im Jahr 2020 konstruierten Yao Y et al. 96 Rektumkarzinom-Organoide anhand von Biopsien aus 112 Fällen von lokal fortgeschrittenem Rektumkarzinom und wählten 80 davon aus, um ihr Ansprechen auf Strahlentherapie zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass Rektumkarzinom-Organoide empfindlich auf Strahlentherapie und die des Patienten reagierten klinische Reaktion. Die Ergebnisse zeigten, dass die Empfindlichkeit von Rektumkrebs-Organoiden gegenüber Strahlentherapie in hohem Maße mit dem klinischen Ansprechen der Patienten übereinstimmte (Sensitivität 78 %, Spezifität 92 %, Genauigkeit 84 %). Anschließend wurde auch bei Tumoren wie Magenkrebs und Brustkrebs eine Übereinstimmung zwischen PDO und der Reaktion von Tumorpatienten auf Medikamente festgestellt. Yan HHN et al. erstellten eine Magenkrebs-Organoidbibliothek unter Verwendung von Tumorgeweben, parakanzerösen Geweben und Lymphknotenmetastasen von 34 Magenkrebspatienten. Zwei von ihnen entwickelten Tumormetastasen und erhielten nach der Operation eine Kombination aus Cisplatin und 5-FU, die beide gut ansprachen. Der andere Fall erhielt vor der Operation eine Chemotherapie und reagierte nach der Operation nicht auf Capecitabin. Die Untersuchung der Empfindlichkeit der entsprechenden PDO-Verbindungen in diesen drei Fällen zeigte, dass die Arzneimittelempfindlichkeit von PDO perfekt mit der klinischen Reaktion jedes Patienten übereinstimmte. Guillen KP et al. konstruierten PDX und PDO unter Verwendung von Tumorproben aus endokrintherapieresistenten, Patienten mit rezidiviertem und metastasiertem Brustkrebs wurden untersucht, und diese Proben wurden histomorphologisch, genomisch und auf Arzneimittelsensitivität untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl Brustkrebs-PDX als auch PDO die histobiologischen und genomischen Eigenschaften ihrer Ursprungstumoren stark reduzierten und beide konsistent auf Antitumormedikamente ansprachen. Eine Patientin mit dreifach negativem Brustkrebs im Stadium IIA entwickelte in dieser Studie etwa ein Jahr nach der präoperativen Chemotherapie und chirurgischen Behandlung Lebermetastasen. Die Forscher unterzogen die Konstrukte PDO und PDX einem Ex-vivo-Test auf Arzneimittelempfindlichkeit und stellten fest, dass der Mikrotubuli-Inhibitor Eribulin die beste therapeutische Wirkung hatte. Basierend auf diesem Ergebnis wurden die Patienten angewiesen, sich einer Behandlung mit Eribulin zu unterziehen, die fast fünf Monate nach der Gabe zu einer vollständigen Remission der Lebermetastasen führte. Diese Studien bestätigen in gewissem Maße die Möglichkeit, dass PDO die Medikation von Patienten mit klinischen Tumoren steuern kann. Es wurde auch gezeigt, dass durch den Vergleich der unterschiedlichen Reaktion auf Medikamente zwischen normalähnlichen Organen und PDO festgestellt wurde, dass Medikamente mit hoher Selektivität dazu beitragen, toxische Nebenwirkungen bei klinischen Patienten zu reduzieren. Daher ist es klar, dass Arzneimittelsensitivitätstests durch PDO zur Ermittlung des am besten geeigneten Arzneimittelschemas dazu beitragen werden, die klinische Wirksamkeit von Tumorpatienten zu verbessern, toxische Nebenwirkungen, das Risiko einer Arzneimittelresistenz und die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens des Tumors zu verringern und den Nutzen zu maximieren Patienten.

   Daher werden wir uns auf von Patienten abgeleitete Modelle von Blasenkrebs-Organoiden stützen und nicht-muskelinvasive Experimente zur Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit bei Perfusionschemotherapie bei Blasenkrebs durchführen, ein standardisiertes Arzneimittelempfindlichkeitstestsystem für Blasenkrebs-Organoide etablieren und Screening-Standards für Arzneimittelempfindlichkeitstests formulieren Blasenkrebs-Organoiden, um das optimale Medikamentenkombinationsschema zu ermitteln, bei der klinischen Entwicklung neuer individueller Behandlungsprotokolle zu helfen und eine multizentrische klinische Validierung durchzuführen, um einen echten „Ersatzmedikamententest“ zu erreichen.

2. Forschungsfragen und Ziele Forschungsfragen: Diese Studie vergleicht die einjährige tumorfreie Rezidivüberlebensrate und die dreijährige tumorfreie Rezidivüberlebensrate von Patienten in der Organoid-sensitiven Arzneimittelinfusionsgruppe, der Organoid-unempfindlichen Arzneimittelinfusionsgruppe, und der BCG-Infusionsgruppe mittels einer Kohortenstudie, und der Unterschied in der Rezidivrate zwischen den drei Gruppen wird durch eine einseitige K-M-Überlebensanalyse verglichen. Bewertung zur Bewertung des Werts von Arzneimittelsensitivitätstests für tumorähnliche Organe bei der Steuerung der individuellen Perfusionschemotherapie bei Blasenkrebs.

   Forschungsziel: Bewertung des Anwendungswerts von Experimenten zur Arzneimittelsensitivität tumorähnlicher Organe bei der Steuerung der individuellen Perfusionschemotherapie bei Blasenkrebs durch Beobachtung der klinischen Wirksamkeit der Methode zur Arzneimittelsensitivität tumorähnlicher Organe bei der Steuerung der postoperativen Perfusionschemotherapie bei Blasenkrebspatienten.

   Einzelheiten finden Sie unter Ergebnismessungen

3. Forschungsmethodik 3.1 Studiendesign Dieses Protokoll basiert auf den Technischen Richtlinien für klinische Studien zu antineoplastischen Arzneimitteln und basiert auf einer multizentrischen Kohortenstudie.

3.1.1 Gruppierung Siehe Gruppen und Interventionen für Einzelheiten 3.1.2 Organoidpräparat für Blasenkrebs

1. Entnahme von Blasenkrebsproben Der Prozess der Probenentnahme erfolgt im Einklang mit den ethischen Grundsätzen des Krankenhauses und der unterzeichneten Einverständniserklärung. Bei Patienten, die an dem Experiment teilnehmen, muss eine pathologische Diagnose von Blasenkrebs gestellt werden, und die Größe der chirurgisch entnommenen Tumorproben sollte möglichst größer als 0,8 cm*3 sein, um eine pathologische Überprüfung, eine Organoidkultur, einen Arzneimittelsensitivitätstest usw. zu ermöglichen. Tumorgewebe sollten unter Berücksichtigung der Zeit der Gewebeischämie und der Kryokonservierung gesammelt werden, und die Entnahmezeit sollte innerhalb von 5 Minuten liegen, wenn das Gewebe aus dem menschlichen Blutkreislauf entfernt wird, um eine Stressnekrose des Tumorgewebes aufgrund einer frühen Hypoxie zu vermeiden.
2. Vorbereitung von Organen bei Blasenkrebs Bei der Gewebeverarbeitung wurden die Gewebeproben physikalisch zerkleinert und mit Kollagenase aufgeschlossen. Die verarbeiteten und verdauten Organoide mussten vor der Kultivierung durch Zellsiebe mit unterschiedlichen Durchmessern gefiltert werden, um die erhaltenen Organoide herzustellen einheitlich in der Größe und erleichtern die Vereinheitlichung von Standards. Anschließend wurden sie in ein dreidimensionales Matrixgel gepflanzt und in einem speziellen Medium kultiviert.
3. Expansion und Kultur von Blasenkrebs-Organoiden Der Wachstumsstatus der Organoide wurde mikroskopisch beobachtet und Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden verwendet, um die Organoide zu charakterisieren, das Vorhandensein von Tumorzellen zu bestätigen und ihre Morphologie zu bewerten. Karzinoidorgane von Blasenkrebs wurden passagiert und eingefroren.

3.1.3 Blasenkrebs-Tumor-Organoid-Arzneimittelsensitivitätstest Nachdem die Anzahl der Organoide unter dem Mikroskop beobachtet wurde, um die Anzahl zu erreichen, die einem Arzneimittelsensitivitätstest unterzogen werden kann, wurde das Organoidmedium abgesaugt und verworfen. Geben Sie 3 ml Verdauungslösung in die Petrischale, blasen Sie die Tröpfchen auseinander, verdauen Sie bei 37 °C, blasen Sie die Organoide aus und beobachten Sie unter dem Mikroskop, wann die Organoide zu einer homogenen Zellmasse mit 2–3 Zellen verdaut sind. Geben Sie das Zweifache hinzu Volumen der Verdauungslösung, um die Verdauung zu beenden. 1500 U/min, zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang und aspirieren Sie dann den Überstand und verwerfen Sie ihn.

Resuspendieren Sie die Zellen mit Medium, achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen, und verdünnen Sie das Medium im Verhältnis 1:1,5 zu Gel. Anschließend beimpfen Sie das gemischte Gel mit 10 µL/Well mit einer Einkanalpipette in vorgekühlte 384-Well-Platten mit 3.000 Organoiden pro Vertiefung (dieser Vorgang wurde auf Eis durchgeführt). Nach dem Mischen des Mediums mit dem Gummi im Verhältnis 1:1 (40 µL:40 µL) wurde das Medium als Blindgruppe in einer Menge von 10 µL/Well in die 384-Well-Platte verteilt. Nach leichtem Klopfen auf die 384-Well-Platte, sodass die Geltröpfchen flach auf dem Boden der Wells lagen, wurde die Platte 30 Minuten lang in einen Inkubator gestellt, damit sich die Geltröpfchen verfestigen konnten, und vorgewärmtes BCOs-Medium wurde mit 40 µL zugegeben /Also. Den Medikamententestvertiefungen sowie den leeren Vertiefungen rund um die Kontrollvertiefungen wurden 40 µL PBS-Lösung zugesetzt und in einen Kohlendioxid-Inkubator gestellt, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit verdunstet und die Geltropfen austrocknen.

Nach 3 Tagen Inkubation und Beobachtung wurde eine mikroskopische Beobachtung des Zustands der Probe in jeder Vertiefung für den Halbvolumen-Flüssigkeitsaustausch durchgeführt.

Entwerfen Sie das Protokoll für den Arzneimittelsensitivitätstest gemäß den Anforderungen der folgenden Tabelle, richten Sie die Kontrollgruppe, die Blindgruppe und die Arzneimitteltestgruppe ein. Das Arzneimittel wurde gemäß den Anweisungen aufgelöst und jeweils vierfach in 6 Konzentrationen mit organoidem Medium verdünnt. Unter Verwendung eines Lumineszenzzell-Lebensfähigkeitstests wurde das Arzneimittel bei verschiedenen Konzentrationen der semihemmenden Konzentration (IC50), der Hemmung von Tumorzellen (IR), dem Grad der Abweichung der IC50 von der Arzneimittelkonzentration im Blut und der AUC (Fläche unter der Dosis) getestet -Reaktionskurve) verwenden die Bewertungskriterien der Ergebnisse des Arzneimittelsensitivitätstests IC50 und IR als Hauptindizes, zusammen mit dem Grad der Abweichung von IC50 von der Arzneimittelkonzentration im Blut und den AUC-Ergebnissen als Hilfsbeurteilung (Einzelheiten siehe siehe 3.10.3), um die Auswirkungen auf das Überleben und die Vermehrung der Organismenklasse zu bewerten und klinische Leitlinien für die Verwendung des Arzneimittels zu geben.

Tabelle 1 Methoden zur Gruppierung von Medikamentensensitivitätstests Gruppierungsmethode für Medikamentensensitivitätstests Leergruppe: Kein Organoid, kein zugesetztes Medikament, 6 Replikatvertiefungen pro Platte. Kontrollgruppe: Mit Organoiden geimpft, keine zusätzliche Arzneimittelexposition. Drogentestgruppe: Mit Organoid geimpft, Drogenexposition hinzufügen. 3.1.4 Kombinationsschemata für Chemotherapeutika Tabelle 2 Perfusionschemotherapeutika Gemcitabin □ Pirorubicin □ Epirubicin □ Silvestrol □ Adriamycin (Doxorubicin) □ 3.2 Studienort und Studienpopulation (Quelle und Einschlussausschlusskriterien) Einzelheiten finden Sie im Studiendesign. 3.3 Studienvariablen (Faktoren) und Messungen Das Positive Die Kontrollgruppe wurde keiner Organoidkultur und keinem Organoid-Arzneimittelempfindlichkeitstest unterzogen.

Die übrigen Patienten wurden einem Organoid-Arzneimittelsensitivitätstest gemäß dem Arzneimittelsensitivitätstestprotokoll unterzogen, wobei ein Lumineszenzzelllebensfähigkeitstest verwendet wurde, um die semihemmende Konzentration (IC50) des Arzneimittels, die Hemmungsrate (IR) der Tumorzellen und den Grad zu testen der Abweichung des IC50 von der Blutarzneimittelkonzentration und der AUC (Fläche unter der Dosis-Wirkungs-Kurve) bei verschiedenen Konzentrationen, und die Bewertungskriterien der Ergebnisse der Arzneimittelsensitivitätstests basierten auf IC50, IR als Hauptindizes mit der IC50-Abweichung von der Blutarzneistoffkonzentration dienen die AUC-Ergebnisse als Hilfsbeurteilung (siehe 3.10.3). für Einzelheiten), um seine Wirkung auf das Überleben und die Proliferation von Klassenorganen zu beurteilen.

Patienten, die sich einer Organoidkultur und einem Arzneimittelempfindlichkeitstest unterzogen hatten, erhielten entsprechend der Erfahrung von Ärzten eine Instillation von Chemotherapeutika in die Blase. Zu den fünf perfundierten Medikamenten gehörten Gemcitabin, Piroxicam, Epirubicin, Mitomycin und Adriamycin (Doxorubicin). Entsprechend der Empfindlichkeit ihrer Perfusionsmedikamente im Organoid-Arzneimittelsensitivitätstest wurden sie in eine Organoid-empfindliche Arzneimittelperfusionsgruppe und eine Organoid-unempfindliche Arzneimittelperfusionsgruppe eingeteilt. Perfusionsschema: einschließlich Induktionsperfusionschemotherapie (4–8 Wochen nach der Operation, 1 Mal pro Woche, insgesamt 4 Mal) und Erhaltungsperfusionschemotherapie (1 Mal pro Monat, insgesamt 11 Mal).

BCG-Infusionsschema: 6 Induktionsinfusionen, gefolgt von 3 Auffrischungsinfusionen einmal alle 2 Wochen, um eine gute Immunantwort aufrechtzuerhalten, gefolgt von 10 Erhaltungsinfusionen einmal im Monat für insgesamt 19 Infusionen über 1 Jahr.

Klinische Messungen: Die beiden Patientengruppen in der Organoid-sensitiven Medikamentenperfusionsgruppe und der Organoid-nicht-sensitiven Medikamentenperfusionsgruppe wurden nachverfolgt und hinsichtlich der primären und sekundären Studienendpunkte analysiert, und es wurde eine einseitige Kaplan-Meier-Überlebensanalyse durchgeführt um die Unterschiede in den Wiederholungsraten zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. Das COX-Risikoanteilsmodell wurde verwendet, um das Rezidivrisikoverhältnis von Geschlecht, Alter, Tumorstadium und -grad der Patienten zwischen den beiden Gruppen zu analysieren.

3.4 Studienergebnisse RECIST1.1-Kriterien wurden für die Wirksamkeitsbewertung verwendet, und Choi-Kriterien und mRECIST-Kriterien wurden als Hilfskriterien für die Wirksamkeitsbewertung verwendet.

Primäre Studienendpunkte: einjährige tumorrezidivfreie Überlebensrate, dreijährige tumorrezidivfreie Überlebensrate.

Sekundäre Endpunkte: einjährige tumorprogressionsfreie Überlebensrate, dreijährige tumorprogressionsfreie Überlebensrate.

3.5 Follow-up Die beiden Patientengruppen in der Gruppe der organähnlichen, empfindlichen Arzneimittelperfusion und der Gruppe der organähnlichen, nicht empfindlichen Arzneimittelperfusion wurden nachverfolgt und hinsichtlich der primären und sekundären Endpunkte der Studie analysiert.

Die Zystoskopie ist die Methode der Wahl bei der Untersuchung von Patienten mit NMIBC und es gibt keine nicht-invasive Alternative zur Zystoskopie. Daher sollte die NMIBC-Nachsorge auf einer regelmäßigen Zystoskopie basieren. Werden bei der Untersuchung verdächtige Läsionen der Blasenschleimhaut festgestellt, sollte zur Abklärung des pathologischen Befundes eine Biopsie durchgeführt werden. Bei Bedarf werden exfoliative Urinzytologie, CT/CTU oder MRT/MRU durchgeführt, aber keine davon kann die Zystoskopie vollständig ersetzen.

Der Zystoskopie-Überprüfungsplan: NMIBC mit geringem Risiko wird einmal 3 Monate und 12 Monate nach der Operation im 1. Jahr und danach einmal jährlich bis zum 3. Jahr durchgeführt; NMIBC mit mittlerem Risiko wird einmal 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate nach der Operation, alle 6 Monate im 2. Jahr und danach jedes Jahr bis zum 3. Jahr durchgeführt; Hochrisiko-NMIBC wird in den ersten zwei Jahren alle drei Monate und danach bis zum dritten Jahr alle sechs Monate durchgeführt.

3.6 Stichprobengröße Eine Stichprobengröße von 293 Fällen war ausreichend, um die Anforderungen für die Studienendpunkte zu erfüllen.

Es gab 73 Fälle in der Organoid-unempfindlichen Arzneimittelperfusionsgruppe und jeweils 110 Fälle in der Organoid-empfindlichen Arzneimittelperfusionsgruppe und der Positivkontrollgruppe.

Berechnungsgrundlage:

1. Berechnung der Stichprobengröße für den Endpunkt der einjährigen tumorfreien Überlebensrate: Die einjährige tumorfreie Überlebensrate wird voraussichtlich 73 % in der Organoid-sensitiven Arzneimittelinfusionsgruppe und 50 % in der organoid-unsensitiven Gruppe betragen Arzneimittelinfusionsgruppe mit einseitigem α = 0,05, β = 0,2 und dem Verhältnis der Stichprobengrößen der beiden Gruppen beträgt 1 (Versuchsgruppe: Kontrollgruppe). Die Stichprobengrößen der beiden Gruppen betragen 55 Fälle in der Versuchsgruppe. 55 Fälle in der Kontrollgruppe und 110 Fälle in der Positivkontrollgruppe. 55 Fälle in der Kontrollgruppe, insgesamt 110 Fälle, und unter Berücksichtigung von 20 % Haarausfall ist eine Gesamtstichprobengröße von 138 Fällen erforderlich.
2. Berechnen Sie die Stichprobengröße gemäß dem Endpunkt der dreijährigen Studie zur tumorfreien Überlebensrate: Es wird erwartet, dass die dreijährige tumorfreie Überlebensrate der Gruppe mit Organoid-sensitiven Arzneimittelinfusionen 63 % beträgt und die dreijährige tumorfreie Überlebensrate 63 % beträgt. Die jährliche tumorfreie Überlebensrate der Organoid-unempfindlichen Arzneimittelinfusionsgruppe beträgt 40 %, und das einseitige α = 0,05, β = 0,2 und das Verhältnis der Probengrößen der beiden Gruppen betragen 1 (Versuchsgruppe: Kontrollgruppe). ), so dass die Stichprobengrößen der beiden Gruppen als 58 Fälle in der Versuchsgruppe, 58 Fälle in der Kontrollgruppe und 11 Fälle in der Kontrollgruppe unter Berücksichtigung von 20 % Haarausfall und einer Gesamtstichprobengröße von berechnet werden Es werden 138 Fälle benötigt. 58 Fälle in der Kontrollgruppe, insgesamt 116 Fälle, und unter Berücksichtigung von 20 % Haarausfall war eine Gesamtstichprobengröße von 146 Fällen erforderlich.
3. Nach den Ergebnissen der Literatur beträgt die einjährige tumorfreie Überlebensrate der Positivkontrollgruppe 75 % und nach dem Vortest die einjährige tumorfreie Überlebensrate der organoidsensitiven Arzneimittelinfusion Es wird erwartet, dass die Stichprobengröße der Gruppe bei 73 % liegt und der Nicht-Minderwertigkeits-Grenzwert 0,2 beträgt (Kontrollgruppe-Versuchsgruppe), und das Verhältnis der Stichprobengrößen der beiden Gruppen ist eins, wobei das einseitige Alpha 0,05 und das Beta 0,2 beträgt Die Stichprobengröße der beiden Gruppen wird mit 74 Fällen der organoidempfindlichen Arzneimittelinfusionsgruppe, 74 Fällen der Positivkontrollgruppe und insgesamt 116 Fällen der Versuchsgruppe berechnet. 74 Fälle und 74 Fälle in der Positivkontrollgruppe, also insgesamt 148 Fälle. Unter Berücksichtigung eines Haarausfalls von 20 % beträgt die erforderliche Gesamtstichprobengröße 186 Fälle.
4. Nach den Ergebnissen der Literatur beträgt die 3-jährige tumorfreie Überlebensrate der Positivkontrollgruppe 65 % und nach dem Vortest die 3-jährige tumorfreie Überlebensrate der organoidsensitiven Arzneimittelinfusion Es wird erwartet, dass die Stichprobengröße der Gruppe bei 63 % liegt und der Nichtunterlegenheits-Grenzwert 0,2 beträgt (Kontrollgruppe-Testgruppe). Das Verhältnis der Stichprobengrößen der beiden Gruppen beträgt 1, wenn das einseitige Alpha 0,05 und das Beta 0,05 beträgt 0,2, die Stichprobengröße der beiden Gruppen wird mit 88 Fällen der organoidempfindlichen Arzneimittelinfusionsgruppe und 88 Fällen der Positivkontrollgruppe berechnet. 88 Fälle und 88 Fälle in der Positivkontrollgruppe, insgesamt 176 Fälle, und unter Berücksichtigung von 20 % Haarausfall war eine Gesamtstichprobengröße von 220 Fällen erforderlich.

3.7 Flussdiagramm der Forschungstechniken Dieser Abschnitt (Bilder) beschreibt den technischen Ablauf des Projekts. 3.8 Datenerfassung und -verwaltung Die Daten wurden durch Beobachtung und Aufzeichnung gesammelt und die Originaldaten wurden Element für Element überprüft, um sicherzustellen, dass die Daten mit denen in den Originalaufzeichnungen übereinstimmten. Am Ende des Experiments wurde es dem Statistiker zur statistischen Analyse übergeben.

3.9 Statistische Analysemethoden Bei den Messdaten handelt es sich im Allgemeinen um deskriptive Statistiken mit Mittelwert, Standardabweichung, Median, Minimal- und Maximalwerten. Für kategoriale Variablen werden deskriptive Statistiken nach Häufigkeit und Prozentsatz durchgeführt.

Für die statistische Analyse wurde die Statistiksoftware SPSS eingesetzt. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (x ± s), t-Test, einfaktorielle ANOVA (Zwei-mal-zwei-Vergleiche nach dem Hoc-Test mit der LSD-Methode) ausgedrückt. Zum Vergleich der Raten wurde der Chi-Quadrat-Test verwendet. und die Methode von Spearman wurde für Korrelationsanalysen verwendet. Bei p < 0,05 wurde davon ausgegangen, dass der Unterschied statistisch signifikant war.

3.10 Qualitätskontrolle 3.10.1 Ergebnisse der HE-Färbung und Immunhistochemie der Klassenorgane Entsprechen den pathologischen Testergebnissen, was darauf hinweist, dass die konstruierten Organoid- und Tumorproben die pathologische Stabilität besser beibehalten können.

3.10.2 Organoid-WES- oder RNA-Seq-Analyse Konstruierte Organoid- und Tumorproben können die genetische Stabilität besser bewahren. 3.10.3 Bewertungskriterien für Ergebnisse von Medikamentensensitivitätstests Der Bewertungsstandard für Ergebnisse von Medikamentensensitivitätstests ist IC50,IR als Hauptindex, wobei der Grad der Abweichung zwischen IC50 und Blutarzneimittelkonzentration, AUC-Ergebnissen als Hilfsbeurteilung dient, wenn die IC50, IR-sensitiven Indizes verwendet werden werden gleichzeitig erfüllt, gilt es als sensibel; Wenn es nicht möglich ist, die IC50- und IR-Indizes gleichzeitig zu erfüllen, wird IC50 mit dem IC50 kombiniert und es ist eine Konzentration des Verhältnisses des kleineren Differenzgrades in den Ergebnissen der Empfindlichkeit erforderlich.

3.10.3.1 IC50-Bewertungskriterien. IC50>20× Nicht empfindlich

1×<IC50≤20× Geringe Empfindlichkeit 0,5×<IC50≤1× Mäßig empfindlich IC50≤0,5× hochsensibel Zur sensiblen Gruppe gehören stark sensible und mäßig empfindliche Personen, und zur unempfindlichen Gruppe gehören schwach empfindliche und resistente Personen.

3.10.3.2 Bewertungskriterien für die IR-Tumorhemmrate. IR <30 % ist unempfindlich und wird als negativ eingestuft; IR≥30 % ist empfindlich und wird als positiv eingestuft, wobei 30 %≤IR<50 % eine geringe Empfindlichkeit, 50 %≤IR<70 % eine mäßige Empfindlichkeit und IR≥70 % eine hohe Empfindlichkeit bedeuten.

Sensitivitätsrate = Anzahl der Fälle mit IR ≥ 30 % / Gesamtzahl der Fälle in der Gruppe.

3.10.3.3 Berechnung des Grads der Abweichung von IC50 von der Blutkonzentration: Der Grad der Abweichung von der Blutkonzentration bezieht sich auf den Grad der Differenz zwischen dem IC50-Wert aus dem Arzneimittelsensitivitätstest und der Blutkonzentration und wird als IC50/Blutkonzentration berechnet.

Je kleiner das Verhältnis, desto wirksamer ist das Medikament. 3.10.3.4 Kriterien für die Bewertung der AUC-Ergebnisse (Fläche unter der Arzneimittel-Zeit-Kurve): Die spezifische Berechnung der AUC umfasst normalerweise die Integration der Konzentrations-Zeit-Kurve.

Die AUC steht in engem Zusammenhang mit der Dosis-Wirkungs-Beziehung. In der Dosis-Wirkungs-Kurve der Arzneimittelwirksamkeit ist die AUC ein zusammengesetzter Indikator für die Gesamtwirkung eines Arzneimittels auf einen Organismus zwischen Dosis und Wirkung. Eine größere AUC ist normalerweise mit einer besseren therapeutischen Wirkung verbunden.

3.11 Nachbehandlung von Organoiden nach der Studie Die in dieser Studie erfolgreich hergestellten Organoide werden nach der Studie einheitlich vernichtet und gemäß den Normen der biomedizinischen Abfallentsorgung entsorgt.