En forskningsprotokol til evaluering af effektiviteten af ​​perfunderede kemoterapeutiske midler til blærekræft baseret på organoid teknologi

1. Baggrund Blærekræft er en ondartet tumor, der stammer fra blærens uroepithel, og tegner sig for det første sted i forekomsten af ​​genitourinære tumorer i Kina. Blandt dem er blære uroepithelial cancer den mest almindelige, der tegner sig for mere end 90% af blærekræft. I henhold til dybden af ​​tumorinvasionen i blæren og de prognostiske karakteristika er blærekræft klinisk klassificeret i ikke-muskelinvasiv blærekræft (NMIBC) og muskelinvasiv blærekræft (MIBC), med NMIBC som hovedtype, der tegner sig for omkring 75 % af alle blærekræftpatienter.

   NMIBC behandles normalt med transurethral resektion af blæretumor (TURBt). På trods af at være i de tidlige stadier af sygdommen, har NMIBC en høj recidivrate, hvor undersøgelser rapporterer en 5-årig recidivrate på cirka 70 %. Derfor er postoperativ blæreperfusionskemoterapi blevet en vigtig terapeutisk foranstaltning til at forhindre gentagelse af blærekræft. I mere end 60 år har folk udforsket mere effektive blæreperfusionslægemidler og metoder. I 1961 blev Thiotepa brugt til blæreperfusionsterapi og opnåede en vis grad af effektivitet til at forhindre gentagelsen af ​​overfladiske tumorer i blæren. I 1976 mente Morales, at blærekræft var relateret til immundefekter, og derfor har BCG-blæreperfusionsterapi været yderst vellykket, hvilket har skabt en ny måde for immunterapi for blæretumorer , som har været meget værdsat og stadig betragtes som det mest effektive blæreperfusionsmiddel. BCG-inddrypning kan dog forårsage alvorlige bivirkninger, herunder urethrale og prostatagranulomer, blæreirritation, feber, hæmaturi og andre lokale manifestationer og systemiske influenzalignende symptomer, hvilket resulterer i intolerance og afbrydelse af behandlingen hos nogle patienter, hvilket har begrænset den brede kliniske anvendelse af BCG. Undersøgelser har vist, at intravesikal instillation af kemoterapeutiske midler i blæren kan reducere den kortsigtede gentagelsesrate af overfladisk blærekræft med omkring 15%-20% og den langsigtede gentagelsesrate med omkring 6%. I øjeblikket er der mange valg af kemoterapeutiske midler til blæreinstillation, herunder (1) pirenzolubicin; (2) gemcitabin; (3) mitomycin; (4) epirubicin; (5) doxorubicin; (6) vekslende blære-infusionskemoterapi med gemcitabin og pirenzolubicin; og (7) andre kombinerede infusionskemoterapier. Men på grund af den brede vifte af kemoterapeutiske lægemidler, er lægemiddelvalg for det meste afhængig af klinisk erfaring eller visse forskningsresultater, der er ingen ensartet standard, og den er blind, empirisk og randomiseret. Kinesisk urologisk sygdomsdiagnose og retningslinjer for behandling gav heller ikke valget af perfusionslægemidler, og individuelle patienter for nogle kemoterapeutiske lægemidler viser naturlig resistens, når klinikken fastslår, at patienten ikke er følsom over for anvendelsen af ​​lægemidlet, har lægemidlet produceret alvorlige toksiske bivirkninger, og endda føre til fænomenet multi-lægemiddelresistens (multi-lægemiddelresistens, MDR), således at den kliniske gentagelsesrate er stadig så høj som 36%-44%, og på samme tid, tumor af denne gruppe af patienter udvikler sig hurtigt, mister muligheden for at genvælge behandlingsmetoden. Derfor er hvordan man undgår udvælgelsen af ​​primære lægemiddelresistente lægemidler og direkte vælger lægemidler med høj følsomhed for at opnå individualiseret kemoterapi blevet et hot spot i forskningen i blæreperfusionskemoterapi.

   Realiseringen af ​​præcisionstumorterapi afhænger i høj grad af påvisningen af ​​lægemiddelfølsomhed. Gennem præcise individualiserede kemoterapeutiske lægemiddelscreeningseksperimenter kan det mest effektive og mindst toksiske terapeutiske regime bedømmes for hver patient før behandlingens start, så at foreslå et kemoterapeutisk regime for en enkelt patient er en ny forskningsretning for at realisere præcisionsbehandlingen af blærekræft og for at forbedre effektiviteten af ​​blærekræftkemoterapi. Tidligere var de mere almindeligt anvendte prækliniske modeller traditionelle tumorcellelinjer og humant afledte tumorvævsxenotransplantater (PDX). Tumorcellelinjekulturmetoden er enkel, men utilstrækkelig til at simulere væksttilstanden af ​​tumorceller hos patienter, og de lægemidler, der screenes af dets lægemiddelscreeningssystem, har lav værdi til klinisk anvendelse.PDX, selvom den kan simulere in vivo tumorkarakteristika og bevare tumoren mikromiljø, har åbenlyse begrænsninger såsom lav stabil tumorgenicitet, lang modellerings- og evalueringsperiode (et halvt år til et år), tidskrævende og besværlig, og det er vanskeligt at generere og bruge til high-throughput lægemiddelscreening. Derfor er udviklingen af ​​lægemiddelfølsomhedsanalysemodeller, der kan efterligne heterogeniteten og kompleksiteten af ​​blærekræft, blevet nødvendig for at udvikle mere personlige terapeutiske og forebyggende strategier for at minimere risikoen og optimere effektiviteten af ​​medicinske indgreb ved at målrette den unikke genetiske, miljømæssige og individers livsstilsegenskaber.

   Patient-Derived Organoids (PDO) er 3D-organoide strukturer dannet af stamceller selv-samlede in vitro, som kan differentieres til flere organ-specifikke celletyper og kan udvise celle-celle og celle-omgivende matrix-interaktioner og rumlige lokaliseringsmønstre, der genskaber in vitro nogle af de vigtigste funktioner og strukturer af rigtige organer, og har en stabil fænotype. strukturer med stabile fænotypiske og genetiske karakteristika. Sammenlignet med todimensionelle tumorcellelinjer og PDX kan tumororganoider dyrkes direkte ved hjælp af patientens eget væv, og samtidig kan disse organoider godt replikere nogle af de primære tumorers nøglekarakteristika, bevare patomorfologien og de biologiske mekanismer. af patientens væv, og bevare heterogeniteten af ​​tumorvævene og et mere realistisk tumormikromiljø, samt have en kort vækstcyklus. Det er nyttigt til dets brug i kliniske cancerpatienter til lægemiddelfølsomhedstest af strålebehandlingslægemidler, molekylært målrettede lægemidler, anti-tumorantistoffer og andre lægemidler til at forudsige patientens reaktion på lægemidler, med potentiale til at hjælpe med beslutninger om klinisk behandling.

   I 2018 rapporterede Science en undersøgelse af brugen af ​​metastatiske gastrointestinale tumorlignende organer til lægemiddelfølsomhedstestning, som sammenlignende analyserede forskellene i følsomhed mellem 21 kliniske patienter og deres tilsvarende PDO'er over for en række målrettede og kemoterapeutiske lægemidler, og resultaterne viste stærk sammenhæng mellem de to. I sammenligning med de faktiske patientresultater var PDO'erne godt forudsagt (sensitivitet 100 %, specificitet 93 %, positiv prædiktiv værdi 88 % og negativ prædiktiv værdi 100 %).20 I 2020 konstruerede Yao Y et al 96 organoider af endetarmskræft ved hjælp af biopsier fra 112 tilfælde af lokalt fremskreden endetarmskræft og udvalgte 80 af dem til at teste deres respons på strålebehandling, og resultaterne viste, at organoider af rektumkræft var følsomme over for strålebehandling og patientens klinisk respons. Resultaterne viste, at følsomheden af ​​organoider af rektalcancer over for strålebehandling var meget i overensstemmelse med patienternes kliniske respons (sensitivitet 78 %, specificitet 92 %, nøjagtighed 84 %). Efterfølgende blev der også fundet overensstemmelse mellem PDO og tumorpatienters respons på lægemidler i tumorer som mavekræft og brystkræft. Yan HHN et al konstruerede et mavekræftorganoidbibliotek ved hjælp af tumorvæv, paracancerøst væv og lymfeknudemetastaser fra 34 mavekræftpatienter. To af dem udviklede tumormetastaser og gennemgik en kombination af cisplatin og 5-FU efter operationen, som begge reagerede godt. Det andet tilfælde fik kemoterapi før operationen og reagerede ikke på capecitabin efter operationen. Undersøgelse af følsomheden af ​​de tilsvarende forbindelser af PDO i disse tre tilfælde viste, at lægemiddelfølsomheden af ​​PDO var i perfekt overensstemmelse med hver patients kliniske respons. Guillen KP et al konstruerede PDX og PDO ved hjælp af tumorprøver fra endokrinterapi-resistente, patienter med tilbagefald og metastaserende brystkræft, og disse prøver blev undersøgt histomorfologisk, genomisk og lægemiddelfølsomhed. Resultaterne viste, at både brystkræft PDX og PDO var stærkt reduktive af de histobiologiske og genomiske egenskaber af deres kildetumorer, og begge reagerede konsekvent på antitumorlægemidler. En patient med triple-negativ brystkræft i stadium IIA udviklede i denne undersøgelse levermetastaser omkring 1 år efter at have gennemgået præoperativ kemoterapi og kirurgisk behandling. Efterforskerne underkastede konstruktionerne PDO og PDX ex vivo lægemiddelfølsomhedstest og fandt, at mikrotubuli-hæmmeren eribulin havde den bedste terapeutiske effekt. Baseret på dette resultat blev patienterne instrueret i at gennemgå behandling med eribulin, hvilket resulterede i fuldstændig remission af levermetastaser i næsten 5 måneder efter dosering. Disse undersøgelser bekræfter til en vis grad muligheden for PDO til at vejlede medicinering af patienter med kliniske tumorer. Det har også vist sig, at ved at sammenligne forskellen i respons på lægemidler mellem normallignende organer og PDO, har det vist sig, at lægemidler med høj selektivitet hjælper med at reducere toksiske bivirkninger hos kliniske patienter. Det er således klart, at lægemiddelfølsomhedstest af PDO for at finde det mest passende lægemiddelregime vil bidrage til at forbedre den kliniske effekt af tumorpatienter, reducere toksiske bivirkninger, risiko for lægemiddelresistens og chancer for tumorgentagelse og maksimere fordelene ved patienter.

   Derfor vil vi, baseret på patientafledte organoide blærekræftmodeller, udføre ikke-muskelinvasive blærekræftperfusionskemoterapi-testeksperimenter for lægemiddelfølsomhed, etablere et standardiseret lægemiddelfølsomhedstestsystem for organoider af blærekræft og formulere screeningsstandarder for lægemiddelfølsomhedstest af blærekræftorganoider, for at screene det optimale lægemiddelkombinationsregime, hjælpe med den kliniske udvikling af nye individualiserede behandlingsprotokoller og udføre multicenter klinisk validering for at opnå en ægte "erstatningslægemiddeltestning".

2. Forskningsspørgsmål og -mål Forskningsspørgsmål: Denne undersøgelse sammenligner overlevelsesraten for et års tumorfrit tilbagefald og den treårige overlevelsesraten for tumorfrit tilbagefald for patienter i den organoid-følsomme lægemiddelinfusionsgruppe, den organoid-ufølsomme lægemiddelinfusionsgruppe, og BCG-infusionsgruppen ved hjælp af et kohortestudie, og forskellen i recidivraten blandt de tre grupper sammenlignes ved envejs K-M overlevelsesanalyse. Vurdering for at evaluere værdien af ​​tumorlignende organlægemiddelfølsomhedsassays til at vejlede individuel perfusionskemoterapi for blærekræft.

   Forskningsmål: at vurdere anvendelsesværdien af ​​tumorlignende organlægemiddelfølsomhedseksperimenter til at vejlede individuel perfusionskemoterapi for blærekræft ved at observere den kliniske effekt af tumorlignende organlægemiddelfølsomhedsmetode til at vejlede postoperativ perfusionskemoterapi til blærekræftpatienter.

   Se Resultatmål for detaljer

3. Forskningsmetodik 3.1 Undersøgelsesdesign Denne protokol er baseret på de tekniske retningslinjer for kliniske forsøg med antineoplastiske lægemidler og vedtager et multicenter, kohortestudie.

3.1.1 Gruppering Se grupper og indgreb for detaljer 3.1.2 Blærekræft organoid forberedelse

1. Prøveindsamling af blærekræft Prøveindsamlingsprocessen er i overensstemmelse med hospitalets etik og underskrevet informeret samtykke. Patienter, der er indskrevet i forsøget, skal være patologisk diagnosticeret med blærekræft, og størrelsen af ​​tumorprøver udtaget kirurgisk bør så vidt muligt være større end 0,8 cm*3 til patologisk verifikation, organoid dyrkning, lægemiddelfølsomhedstest, og så videre. Tumorvæv bør opsamles med opmærksomhed på vævsiskæmi-tid og kryopræservering, og opsamlingstiden bør være inden for 5 minutter, når vævene fjernes fra den menneskelige blodcirkulation, for at undgå stressnekrose af tumorvævene på grund af tidlig hypoxi.
2. Forberedelse af blærekræftorganer I processen med vævsbearbejdning blev fysisk knusning og kollagenasefordøjelse brugt til at behandle vævsprøverne, og de forarbejdede og fordøjede organoider skulle filtreres gennem cellesier med forskellige diametre før dyrkning for at fremstille de opnåede organoider ensartet i størrelse og lette ensretningen af ​​standarder. Derefter blev de plantet i tredimensionel matrixgel og dyrket i specielt medium.
3. Ekspansion og dyrkning af organoider af blærekræft Organoidernes vækststatus blev observeret mikroskopisk, og immunhistokemi og immunfluorescens blev brugt til at karakterisere organoiderne, bekræfte tilstedeværelsen af ​​tumorceller og til at evaluere deres morfologi. Blærekræftkarcinoide organer blev passeret og frosset.

3.1.3 Organoid lægemiddelfølsomhedstestning af blærekræfttumor Efter at have observeret antallet af organoider under mikroskop for at nå det antal, der kan udsættes for lægemiddelfølsomhedstestning, blev det organoide medium aspireret og kasseret. Tilsæt 3 mL fordøjelsesopløsning til petriskålen, blæs dråberne fra hinanden, fordøj ved 37 ℃, blæs organoiderne og observer under mikroskop, når organoiderne er fordøjet til en homogen cellemasse indeholdende 2-3 celler, tilsæt 2 gange volumen af ​​fordøjelsesopløsningen for at afslutte fordøjelsen. 1500 rpm, centrifuger cellerne i 3 minutter, og aspirér derefter og kasser supernatanten.

Resuspender cellerne med medium, prøv ikke at producere luftbobler, og fortynd forholdet mellem medium til gel 1:1,5, inokulér derefter den blandede gel ved 10 µl/brønd med en enkeltkanalspipette i forkølede 384-brøndsplader med 3.000 organoider brønd (denne operation blev udført på is). Efter blanding af mediet med gummiet i et forhold på 1:1 (40 uL:40 uL) blev mediet dispenseret i 384-brøndspladen ved 10 uL/brønd som en blank gruppe. Efter forsigtigt at banke på pladen med 384 brønde, så gel-dråberne lå fladt på bunden af ​​brøndene, blev pladen anbragt i en inkubator i 30 minutter for at tillade gel-dråberne at størkne, og forvarmet BCOs-medium blev tilsat ved 40 uL /godt. Til lægemiddeltestbrøndene såvel som til de tomme brønde omkring kontrolbrøndene blev 40 µl PBS-opløsning tilsat og anbragt i en kuldioxidinkubator for at forhindre væsken i at fordampe og få gel-dråberne til at tørre ud.

Efter 3 dages inkubation og observation blev der udført mikroskopisk observation af status for prøven i hver brønd for halv-volumen væskeudveksling.

Design lægemiddelfølsomhedstestprotokollen i overensstemmelse med kravene i den følgende tabel, opstil kontrolgruppen, blankgruppen og lægemiddeltestgruppen, lægemidlet blev opløst i henhold til instruktionerne og fortyndet 4 gange i 6 koncentrationer med henholdsvis organoid medium; under anvendelse af luminescerende cellelevedygtighedsassay blev lægemidlet testet ved forskellige koncentrationer af den semi-hæmmende koncentration (IC50), hæmning af tumorceller (IR), graden af ​​afvigelse af IC50 fra lægemiddelkoncentrationen i blodet, AUC (areal under dosis) -responskurve), tager evalueringskriterierne for resultaterne af lægemiddelfølsomhedsanalysen IC50 og IR som hovedindekser, sammen med graden af ​​afvigelse af IC50 fra lægemiddelkoncentrationen i blodet og AUC-resultaterne som hjælpebedømmelsen (for detaljer, se venligst 3.10.3), at vurdere virkningerne på overlevelse og spredning af klassen af ​​organismer, og at give den kliniske vejledning i brugen af ​​lægemidlet.

Tabel 1 Metoder til gruppering af lægemiddelfølsomhedstests Grupperingsmetode til lægemiddelfølsomhedstest Blank gruppe: Ingen organoid, intet lægemiddel tilsat, 6 replikatbrønde pr. plade. Kontrolgruppe: Inokuleret med organoider, ingen tilføjet lægemiddeleksponering. Lægemiddeltestgruppe: Inokuleret med organoid, tilføje lægemiddeleksponering. 3.1.4 Lægemiddelkombinationsregimer til kemoterapi Tabel 2 Perfusionskemoterapilægemidler Gemcitabin □ Pirorubicin □ Epirubicin □ Silvestrol □ Adriamycin(doxorubicin) □ 3.2 Undersøgelsessted og undersøgelsespopulation (kilde- og inklusionseksklusionskriterier) Se undersøgelsesdesign for detaljer 3.3 Undersøgelser Variabler og Undersøgelser positive. kontrolgruppen blev ikke udsat for organoidkultur såvel som organoid lægemiddelfølsomhedstest.

De resterende patienter blev udsat for organoid lægemiddelfølsomhedstestning i overensstemmelse med lægemiddelfølsomhedstestprotokollen ved anvendelse af luminescerende cellelevedygtighedsassay til at teste lægemidlets semi-inhiberende koncentration (IC50), hæmningshastigheden (IR) af tumorcellerne, graden af afvigelse af IC50 fra lægemiddelkoncentrationen i blodet og AUC (arealet under dosis-responskurven) ved forskellige koncentrationer, og evalueringskriterierne for resultaterne af lægemiddelfølsomhedstest var baseret på IC50,IR som hovedindekser med IC50-afvigelsen fra lægemiddelkoncentrationen i blodet, resulterer AUC som en hjælpevurdering (se 3.10.3 for detaljer), for at vurdere dets effekt på overlevelse og spredning af klasseorganer.

Patienter, der gennemgik organoid dyrkning og testning af lægemiddelfølsomhed, gennemgik blæreinddrypning af kemoterapeutiske midler ifølge erfaring fra klinikere. De fem perfunderede lægemidler omfattede gemcitabin, piroxicam, epirubicin, mitomycin og adriamycin (doxorubicin). Ifølge følsomheden af ​​deres perfusionslægemidler i organoid-lægemiddelfølsomhedstest blev de opdelt i organoid-følsomme lægemiddelperfusionsgruppe og organoid ikke-følsomme lægemiddelperfusionsgruppe. Perfusionsregime: inklusive induktionsperfusionskemoterapi (4-8 uger efter operationen, 1 gang om ugen, 4 gange i alt) og vedligeholdelsesperfusionskemoterapi (1 gang om måneden, 11 gange i alt).

BCG-infusionsregime: 6 induktionsinfusioner efterfulgt af 3 booster-infusioner en gang hver 2. uge for at opretholde et godt immunrespons, efterfulgt af 10 vedligeholdelsesinfusioner en gang om måneden i i alt 19 infusioner over 1 år.

Kliniske målinger: de to grupper af patienter i den organoid-sensitive lægemiddelperfusionsgruppe og den organoid-ikke-sensitive lægemiddelperfusionsgruppe blev fulgt op og analyseret for de primære og sekundære undersøgelses endepunkter, og envejs Kaplan-Meier overlevelsesanalyse blev udført at sammenligne forskellene i gentagelsesrater mellem de to grupper. COX-risikoandelsmodellen blev brugt til at analysere gentagelsesrisikoforholdet for patienternes køn, alder, tumorstadie og grad mellem de to grupper.

3.4 Undersøgelsesresultater RECIST1.1-kriterier blev brugt til effektivitetsevaluering, og Choi-kriterier og mRECIST-kriterier blev brugt som hjælpekriterier for effektivitetsevaluering.

Primære undersøgelses endepunkter: overlevelsesraten uden tumortilbagefald i et år, overlevelsesraten uden tumortilbagefald i tre år.

Sekundære endepunkter: et års tumorprogressionsfri overlevelsesrate, treårig tumorprogressionsfri overlevelsesrate.

3.5 Opfølgning De to grupper af patienter i den organlignende følsomme lægemiddelperfusionsgruppe og den organlignende ikke-følsomme lægemiddelperfusionsgruppe blev fulgt op og analyseret for de primære og sekundære undersøgelsens endepunkter.

Cystoskopi er den foretrukne metode ved gennemgang af patienter med NMIBC, og der er ikke noget non-invasivt alternativ til cystoskopi. Derfor bør NMIBC-opfølgning være baseret på regelmæssig cystoskopi. Hvis der under undersøgelsen konstateres mistænkelige læsioner af blæreslimhinden, bør der foretages biopsi for at afklare de patologiske fund. Urineksfoliativ cytologi, CT/CTU eller MRI/MRU udføres om nødvendigt, men ingen af ​​dem kan helt erstatte cystoskopi.

Cystoskopigennemgangsplanen: lavrisiko NMIBC udføres én gang ved 3 måneder og 12 måneder efter operationen i det 1. år og en gang om året derefter indtil det 3. år; NMIBC med mellemrisiko udføres én gang 3 måneder, 6 måneder og 12 måneder efter operationen, hver 6. måned i det 2. år og hvert år derefter indtil det 3. år; højrisiko NMIBC udføres hver 3. måned i de første 2 år, og hver 6. måned derefter indtil det 3. år.

3.6 Prøvestørrelse En stikprøvestørrelse på 293 tilfælde var tilstrækkelig til at opfylde kravene til undersøgelsens endepunkter.

Der var 73 tilfælde i den organoide ikke-følsomme lægemiddelperfusionsgruppe og 110 tilfælde hver i den organoidfølsomme lægemiddelperfusionsgruppe og den positive kontrolgruppe.

Beregningsgrundlag:

1. Beregning af prøvestørrelse for endepunkt for undersøgelsen af ​​et-årig tumorfri overlevelsesrate: den etårige tumorfri overlevelsesrate forventes at være 73 % i den organoid-følsomme lægemiddelinfusionsgruppe og 50 % i den organoide ikke-sensitive lægemiddelinfusionsgruppe, med ensidig α=0,05, β=0,2, og forholdet mellem prøvestørrelserne for de to grupper er 1 (eksperimentel gruppe: kontrolgruppe), prøvestørrelserne for de to grupper er 55 tilfælde i forsøgsgruppen, 55 tilfælde i kontrolgruppen og 110 tilfælde i den positive kontrolgruppe. 55 tilfælde i kontrolgruppen, i alt 110 tilfælde, og i betragtning af 20% udfald, kræves en samlet stikprøvestørrelse på 138 tilfælde.
2. Beregn prøvestørrelsen i henhold til endepunktet for det treårige tumorfrie overlevelsesstudie: det forventes, at den treårige tumorfri overlevelsesrate for den organoidfølsomme lægemiddelinfusionsgruppe vil være 63 %, og tre- år tumorfri overlevelsesrate for den organoid-ufølsomme lægemiddelinfusionsgruppe vil være 40 %, og den ensidige α=0,05, β=0,2, og forholdet mellem prøvestørrelserne for de to grupper vil være 1 (eksperimentel gruppe: kontrolgruppe) ), således at stikprøvestørrelserne for de to grupper vil blive beregnet som 58 tilfælde i forsøgsgruppen, 58 tilfælde i kontrolgruppen og 11 tilfælde i kontrolgruppen under hensyntagen til 20 % udskillelse, og en samlet stikprøvestørrelse på Der kræves 138 sager. 58 tilfælde i kontrolgruppen, i alt 116 tilfælde, og i betragtning af 20% udfald, var en samlet stikprøvestørrelse på 146 tilfælde påkrævet.
3. Ifølge resultaterne af litteraturen er den etårige tumorfri overlevelsesrate for den positive kontrolgruppe 75 %, og ifølge prætesten er den etårige tumorfri overlevelsesrate for den organoid-følsomme lægemiddelinfusion. gruppe forventes at være 73 %, og non-inferiority cut-off værdien er 0,2 (kontrolgruppe-eksperimentel gruppe), og forholdet mellem stikprøvestørrelserne for de to grupper er én, hvor den ensidige alfa er 0,05 og beta er 0,2 , er prøvestørrelsen af ​​de to grupper beregnet som 74 tilfælde af den organoid-følsomme lægemiddelinfusionsgruppe, 74 tilfælde af den positive kontrolgruppe og i alt 116 tilfælde af forsøgsgruppen. 74 tilfælde og 74 tilfælde i den positive kontrolgruppe, i alt 148 tilfælde. I betragtning af 20 % udfald er den samlede stikprøvestørrelse 186 tilfælde.
4. Ifølge resultaterne af litteraturen er den 3-årige tumorfri overlevelsesrate for den positive kontrolgruppe 65 %, og ifølge prætesten er den 3-årige tumorfri overlevelsesrate for den organoid-følsomme lægemiddelinfusion. gruppe forventes at være 63 %, og non-inferiority cut-off værdien er 0,2 (kontrolgruppe-testgruppe), og forholdet mellem stikprøvestørrelserne for de to grupper er 1, hvis den ensidige alfa er 0,05, og betaen er 0,2, er prøvestørrelsen af ​​de to grupper beregnet som 88 tilfælde af den organoid-følsomme lægemiddelinfusionsgruppe og 88 tilfælde af den positive kontrolgruppe. 88 tilfælde og 88 tilfælde i den positive kontrolgruppe, i alt 176 tilfælde, og under hensyntagen til 20 % udskillelse var der behov for en samlet stikprøvestørrelse på 220 tilfælde.

3.7 Flowdiagram over forskningsteknikker Dette afsnit (billeder) beskriver projektets tekniske rute. 3.8 Dataindsamling og -styring Data blev indsamlet ved observation og registrering, og de originale data blev kontrolleret punkt for punkt for at sikre, at dataene var i overensstemmelse med dem i de originale optegnelser. Ved afslutningen af ​​forsøget blev det overdraget til statistikeren til statistisk analyse.

3.9 Statistiske analysemetoder Målte data er generelt beskrivende statistik med middelværdi, standardafvigelse, median, minimum og maksimumværdi. For kategoriske variable vil der blive udført beskrivende statistik efter hyppighed og procent.

Statistisk software SPSS blev anvendt til statistisk analyse. Måledata blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (x ± s), t-test, en-vejs ANOVA (post hoc test to-til-to sammenligninger ved brug af LSD-metoden), chi-square test blev brugt til sammenligning af hastigheder, og Spearmans metode blev brugt til korrelationsanalyser. p < 0,05 blev anset for, at forskellen var statistisk signifikant.

3.10 Kvalitetskontrol 3.10.1 Klasseorgan HE-farvning og immunhistokemiresultater Overensstemmende med de patologiske testresultater, hvilket indikerer, at de konstruerede organoid- og tumorprøver bedre kan bevare patologisk stabilitet.

3.10.2 Organoid WES- eller RNA-Seq-analyse Konstruerede organoid- og tumorprøver kan bedre bevare genetisk stabilitet. 3.10.3 Evalueringskriterier for lægemiddelfølsomhedstestresultater Evalueringsstandarden for lægemiddelfølsomhedstestresultater har IC50,IR som hovedindeks, med graden af ​​afvigelse mellem IC50 og blodets lægemiddelkoncentration, AUC-resultater som en hjælpebedømmelse, når IC50, IR-følsomme indekser er mødt på samme tid, betragtes det som følsomt; når det ikke er muligt at opfylde IC50, IR-indekser på samme tid, IC50 kombineret med IC50 og behovet for koncentrationen af ​​forholdet mellem den mindre grad af forskel i resultaterne af følsomheden.

3.10.3.1 IC50 evalueringskriterier. IC50>20× Ikke følsom

1×<IC50≤20× Lav følsomhed 0,5×<IC50≤1× Moderat følsom IC50≤0,5× højsensitiv Den sensitive gruppe omfatter stærkt sensitive og moderat sensitive, og den ufølsomme gruppe omfatter svagt sensitive og resistente.

3.10.3.2 Evalueringskriterier for IR-tumorhæmningshastighed. IR <30 % er ufølsom og klassificeret som negativ; IR≥30% er følsom og klassificeret som positiv, hvor 30%≤IR<50% er lav følsomhed, 50%≤IR<70% er moderat følsomhed, og IR≥70% er høj følsomhed.

Sensitivitetsrate = antal tilfælde med IR ≥ 30% / samlet antal tilfælde i gruppen.

3.10.3.3 Beregning af graden af ​​afvigelse af IC50 fra blodkoncentration: graden af ​​afvigelse fra blodkoncentration refererer til graden af ​​forskel mellem IC50-værdien opnået fra lægemiddelfølsomhedstesten og blodkoncentrationen, og beregnes som IC50/blodkoncentration.

Jo mindre forholdet er, jo mere effektivt er lægemidlet. 3.10.3.4 Kriterier for evaluering af AUC-resultater (areal under lægemiddel-tid-kurven): Den specifikke beregning af AUC involverer sædvanligvis integration af koncentration-tid-kurven.

AUC er tæt forbundet med dosis-respons forholdet. I dosis-respons-kurven for lægemiddeleffektivitet er AUC en sammensat indikator for den samlede effekt af et lægemiddel på en organisme mellem dosis og respons. En større AUC er normalt forbundet med en bedre terapeutisk effekt.

3.11 Behandling af organoid efter undersøgelse De organoider, der er konstrueret med succes i denne undersøgelse, vil blive ensartet destrueret og bortskaffet efter undersøgelsen i overensstemmelse med normerne for bortskaffelse af biomedicinsk affald.