Un protocolo de investigación para evaluar la eficacia de agentes quimioterapéuticos perfundidos para el cáncer de vejiga basado en tecnología organoide

1. Antecedentes El cáncer de vejiga es un tumor maligno que se origina en el uroepitelio de la vejiga y ocupa el primer lugar en la incidencia de tumores genitourinarios en China. Entre ellos, el cáncer uroepitelial de vejiga es el más común y representa más del 90% de los cánceres de vejiga. Según la profundidad de la invasión tumoral en la vejiga y las características pronósticas, el cáncer de vejiga se clasifica clínicamente en cáncer de vejiga no músculo-invasivo (NMIBC) y cáncer de vejiga músculo-invasivo (MIBC), siendo el NMIBC el tipo principal, que representa alrededor del 75% de todos los pacientes con cáncer de vejiga.

   NMIBC generalmente se trata con resección transuretral de tumor de vejiga (TURBt). A pesar de encontrarse en las primeras etapas de la enfermedad, NMIBC tiene una alta tasa de recurrencia; los estudios informan una tasa de recurrencia a 5 años de aproximadamente el 70 %. Por lo tanto, la quimioterapia de perfusión vesical posoperatoria se ha convertido en una medida terapéutica clave para prevenir la recurrencia del cáncer de vejiga. Durante más de 60 años, la gente ha estado explorando medicamentos y métodos de perfusión vesical más efectivos. En 1961, la tiotepa se usó para la terapia de perfusión vesical y ganó un cierto grado de eficacia en la prevención de la recurrencia de tumores superficiales de la vejiga. En 1976, Morales creía que el cáncer de vejiga estaba relacionado con deficiencias inmunes y, en consecuencia, la terapia de perfusión vesical con BCG ha tenido un gran éxito, creando una nueva forma de inmunoterapia para los tumores de vejiga. , que ha sido ampliamente valorado y todavía se considera el fármaco de perfusión vesical más eficaz. Sin embargo, la instilación de BCG puede causar efectos secundarios graves, incluidos granulomas uretrales y prostáticos, irritación de la vejiga, fiebre, hematuria y otras manifestaciones locales y síntomas sistémicos similares a los de la gripe, lo que provoca intolerancia e interrupción del tratamiento en algunos pacientes, lo que ha limitado la amplia gama clínica. aplicación de BCG. Los estudios han demostrado que la instilación intravesical de agentes quimioterapéuticos en la vejiga puede reducir la tasa de recurrencia a corto plazo del cáncer de vejiga superficial en aproximadamente un 15% -20% y la tasa de recurrencia a largo plazo en aproximadamente un 6%. Actualmente existen muchas opciones de agentes quimioterapéuticos para la instilación vesical, entre ellos (1) pirenzolubicina; (2) gemcitabina; (3) mitomicina; (4) epirrubicina; (5) doxorrubicina; (6) alternancia de quimioterapia con infusión vesical con gemcitabina y pirenzolubicina; y (7) otras quimioterapias de infusión combinada. Sin embargo, debido a la amplia variedad de fármacos quimioterapéuticos, la selección de fármacos se basa principalmente en la experiencia clínica o en ciertos resultados de investigación, no existe un estándar uniforme y es ciega, empírica y aleatoria. Las pautas chinas de diagnóstico y tratamiento de enfermedades urológicas tampoco proporcionan la selección de medicamentos de perfusión, y los pacientes individuales para algunos medicamentos quimioterapéuticos muestran resistencia natural, cuando la clínica determina que el paciente no es sensible a la aplicación del medicamento, el medicamento ha producido graves efectos secundarios tóxicos, e incluso conducen al fenómeno de resistencia a múltiples medicamentos (resistencia a múltiples medicamentos, MDR), por lo que la tasa de recurrencia clínica sigue siendo tan alta como 36% -44% y, al mismo tiempo, la El tumor de este grupo de pacientes progresa rápidamente, perdiendo la oportunidad de volver a seleccionar el método de tratamiento. Por lo tanto, cómo evitar la selección de fármacos primarios resistentes a los medicamentos y elegir directamente fármacos con alta sensibilidad para lograr una quimioterapia individualizada se ha convertido en un punto candente en la investigación de la quimioterapia de perfusión vesical.

   La realización de una terapia tumoral de precisión depende en gran medida de la detección de la sensibilidad a los fármacos. A través de experimentos precisos e individualizados de detección de fármacos quimioterapéuticos, se puede juzgar el régimen terapéutico más eficaz y menos tóxico para cada paciente antes de iniciar el tratamiento, por lo que proponer un régimen quimioterapéutico para un solo paciente es una nueva dirección de investigación para realizar un tratamiento de precisión. del cáncer de vejiga y mejorar la eficacia de la quimioterapia contra el cáncer de vejiga. Anteriormente, los modelos preclínicos más utilizados eran las líneas celulares tumorales tradicionales y los xenoinjertos de tejido tumoral (PDX) de origen humano. El método de cultivo de líneas celulares tumorales es simple pero insuficiente para simular el estado de crecimiento de las células tumorales en pacientes, y los medicamentos seleccionados por su sistema de detección de medicamentos tienen poco valor para la aplicación clínica. PDX, aunque puede simular las características del tumor in vivo y preservar el tumor. microambiente, tiene limitaciones obvias, como una tumorigenicidad baja y estable, un largo período de modelado y evaluación (de medio año a un año), que requiere mucho tiempo y es laborioso, y es difícil de generar y utilizar para la detección de fármacos de alto rendimiento. Por lo tanto, se ha vuelto necesario el desarrollo de modelos de ensayo de sensibilidad a los medicamentos que puedan imitar la heterogeneidad y complejidad del cáncer de vejiga para desarrollar estrategias terapéuticas y preventivas más personalizadas para minimizar el riesgo y optimizar la efectividad de las intervenciones médicas dirigidas a factores genéticos y ambientales únicos. y características del estilo de vida de los individuos.

   Los organoides derivados del paciente (PDO) son estructuras organoides tridimensionales formadas por células madre autoensambladas in vitro, que pueden diferenciarse en múltiples tipos de células específicas de órganos y pueden exhibir interacciones entre células y matrices circundantes y patrones de ubicación espacial, recreando in vitro algunas de las funciones y estructuras clave de órganos reales, y que tienen un fenotipo estable. estructuras con características fenotípicas y genéticas estables. En comparación con las líneas celulares tumorales bidimensionales y PDX, los organoides tumorales se pueden cultivar directamente utilizando los propios tejidos del paciente y, al mismo tiempo, estos organoides pueden replicar algunas de las características clave de los tumores primarios y conservar la patomorfología y los mecanismos biológicos. de los tejidos del paciente, y preservar la heterogeneidad de los tejidos tumorales y un microambiente tumoral más realista, además de tener un ciclo de crecimiento corto. Es útil para su uso en pacientes con cáncer clínico para pruebas de sensibilidad a fármacos de radioterapia, fármacos de orientación molecular, anticuerpos antitumorales y otros fármacos, para predecir la capacidad de respuesta del paciente a los fármacos, con el potencial de ayudar en las decisiones de tratamiento clínico.

   En 2018, Science informó sobre un estudio sobre el uso de órganos similares a tumores gastrointestinales metastásicos para pruebas de sensibilidad a medicamentos, que analizó comparativamente las diferencias en la sensibilidad entre 21 pacientes clínicos y sus correspondientes PDO a una serie de medicamentos quimioterapéuticos y dirigidos, y los resultados mostraron fuerte coherencia entre ambos. En comparación con los resultados reales de los pacientes, los PDO se predijeron bien (sensibilidad del 100 %, especificidad del 93 %, valor predictivo positivo del 88 % y valor predictivo negativo del 100 %).20 En 2020, Yao Y et al construyeron 96 organoides de cáncer de recto utilizando biopsias de 112 casos de cáncer de recto localmente avanzado y seleccionaron 80 de ellos para probar su respuesta a la radioterapia, y los resultados mostraron que los organoides de cáncer de recto eran sensibles a la radioterapia y al paciente. respuesta clínica. Los resultados mostraron que la sensibilidad de los organoides del cáncer de recto a la radioterapia fue muy consistente con la respuesta clínica de los pacientes (sensibilidad 78%, especificidad 92%, precisión 84%). Posteriormente, en tumores como el cáncer gástrico y el cáncer de mama, también se encontró la concordancia entre la PDO y la respuesta de los pacientes con tumores a los fármacos. Yan HHN et al construyeron una biblioteca de organoides de cáncer gástrico utilizando tejidos tumorales, tejidos paracancerosos y metástasis en ganglios linfáticos de 34 pacientes con cáncer gástrico. Dos de ellos desarrollaron metástasis tumorales y se sometieron a una combinación de cisplatino y 5-FU después de la cirugía, y ambos respondieron bien. El otro caso recibió quimioterapia antes de la cirugía y no respondió a capecitabina después de la cirugía. El examen de la sensibilidad de los compuestos correspondientes de PDO en estos tres casos mostró que la sensibilidad al fármaco de PDO estaba en perfecto acuerdo con la respuesta clínica de cada paciente. Guillén KP et al construyeron PDX y PDO utilizando muestras de tumores de terapia endocrina resistentes. pacientes con cáncer de mama en recaída y metastásico, y estas muestras se examinaron histomorfológicamente, genómicamente y la sensibilidad a los medicamentos. Los resultados mostraron que tanto el PDX como el PDO del cáncer de mama eran altamente reductores de las propiedades histobiológicas y genómicas de sus tumores de origen, y ambos respondieron consistentemente a los medicamentos antitumorales. Una paciente con cáncer de mama triple negativo en estadio IIA en este estudio desarrolló metástasis hepáticas aproximadamente 1 año después de someterse a quimioterapia preoperatoria y tratamiento quirúrgico. Los investigadores sometieron las construcciones PDO y PDX a pruebas de sensibilidad a fármacos ex vivo y descubrieron que el inhibidor de microtúbulos eribulina tenía el mejor efecto terapéutico. Con base en este resultado, se indicó a los pacientes que se sometieran a tratamiento con eribulina, lo que resultó en una remisión completa de las metástasis hepáticas durante casi 5 meses después de la dosis. Estos estudios confirman en cierta medida la posibilidad de la PDO de guiar la medicación de pacientes con tumores clínicos. También se ha demostrado que al comparar la diferencia en la respuesta a los fármacos entre órganos normales y PDO, se ha descubierto que los fármacos con alta selectividad ayudan a reducir los efectos secundarios tóxicos en pacientes clínicos. Por lo tanto, está claro que las pruebas de sensibilidad a los medicamentos realizadas por PDO para descubrir el régimen farmacológico más apropiado ayudarán a mejorar la eficacia clínica de los pacientes con tumores, reducirán los efectos secundarios tóxicos, el riesgo de resistencia a los medicamentos y las posibilidades de recurrencia del tumor, y maximizarán los beneficios para pacientes.

   Por lo tanto, basándonos en modelos organoides de cáncer de vejiga derivados de pacientes, llevaremos a cabo experimentos de prueba de sensibilidad a fármacos de quimioterapia de perfusión de cáncer de vejiga no invasivos musculares, estableceremos un sistema estandarizado de prueba de sensibilidad a fármacos para organoides de cáncer de vejiga y formularemos estándares de detección para pruebas de sensibilidad a fármacos de organoides de cáncer de vejiga, para detectar el régimen de combinación de medicamentos óptimo, ayudar en el desarrollo clínico de nuevos protocolos de tratamiento individualizados y llevar a cabo una validación clínica multicéntrica para lograr una verdadera "prueba de medicamentos sustitutos".

2. Preguntas y objetivos de investigación Preguntas de investigación: Este estudio compara la tasa de supervivencia de recurrencia libre de tumores a un año y la tasa de supervivencia de recurrencia libre de tumores a tres años de pacientes en el grupo de infusión de fármacos sensibles a organoides, el grupo de infusión de fármacos no sensibles a organoides, y el grupo de infusión de BCG mediante un estudio de cohorte, y la diferencia en la tasa de recurrencia entre los tres grupos se compara mediante un análisis de supervivencia K-M unidireccional. Evaluación para evaluar el valor de los ensayos de sensibilidad a fármacos de órganos similares a tumores para guiar la quimioterapia de perfusión individual para el cáncer de vejiga.

   Objetivo de la investigación: evaluar el valor de la aplicación de experimentos de sensibilidad a fármacos de órganos similares a tumores para guiar la quimioterapia de perfusión individual para el cáncer de vejiga mediante la observación de la eficacia clínica del método de sensibilidad a fármacos de órganos similares a tumores para guiar la quimioterapia de perfusión posoperatoria para pacientes con cáncer de vejiga.

   Ver Medidas de resultado para más detalles.

3. Metodología de investigación 3.1 Diseño del estudio Este protocolo se basa en las Directrices técnicas para ensayos clínicos de fármacos antineoplásicos y adopta un estudio de cohorte multicéntrico.

3.1.1 Agrupación Ver Grupos e Intervenciones para más detalles 3.1.2 Preparación organoide para el cáncer de vejiga.

1. Recolección de muestras de cáncer de vejiga El proceso de recolección de muestras se realiza de acuerdo con la ética hospitalaria y el consentimiento informado firmado. Los pacientes inscritos en el experimento deben tener un diagnóstico patológico de cáncer de vejiga y el tamaño de las muestras de tumor extraídas quirúrgicamente debe ser mayor que 0,8 cm*3 en la medida de lo posible, para la verificación patológica, cultivo de organoides, prueba de sensibilidad a los medicamentos, etc. Los tejidos tumorales se deben recolectar prestando atención al tiempo de isquemia del tejido y la criopreservación, y el tiempo de recolección debe ser dentro de los 5 minutos cuando los tejidos se retiran de la circulación sanguínea humana, para evitar la necrosis por estrés de los tejidos tumorales debido a la hipoxia temprana.
2. Preparación de órganos con cáncer de vejiga En el proceso de procesamiento de tejidos, se utilizó trituración física y digestión con colagenasa para procesar las muestras de tejido, y los organoides procesados ​​y digeridos debían filtrarse a través de tamices celulares de diferentes diámetros antes del cultivo, para producir los organoides obtenidos. uniforme en tamaño y facilitar la unificación de estándares. Luego se plantaron en una matriz de gel tridimensional y se cultivaron en un medio especial.
3. Expansión y cultivo de organoides de cáncer de vejiga El estado de crecimiento de los organoides se observó microscópicamente y se utilizaron inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para caracterizar los organoides, confirmar la presencia de células tumorales y evaluar su morfología. Se pasaron y congelaron órganos carcinoides de cáncer de vejiga.

3.1.3 Prueba de sensibilidad a fármacos organoides de tumores de cáncer de vejiga Después de observar el número de organoides bajo el microscopio para alcanzar el número que puede someterse a pruebas de sensibilidad a fármacos, se aspiró y descartó el medio organoide. Agregue 3 ml de solución digestiva a la placa de Petri, separe las gotas, digiera a 37 ℃, sople los organoides y observe bajo el microscopio, cuando los organoides se digieran en una masa celular homogénea que contenga 2-3 células, agregue 2 veces la Volumen de la solución digestiva para terminar la digestión. 1500 rpm, centrifugar las células durante 3 minutos y luego aspirar y desechar el sobrenadante.

Resuspender las células con medio, tratar de no producir burbujas de aire y diluir el medio a gel en una proporción de 1:1,5, luego inocular el gel mezclado a 10 uL/pocillo con una pipeta de un solo canal en placas de 384 pocillos preenfriadas con 3000 organoides. por pozo (esta operación se realizó en hielo). Después de mezclar el medio con la goma en una proporción de 1:1 (40 ul:40 ul), el medio se distribuyó en la placa de 384 pocillos a 10 ul/pocillo como grupo en blanco. Después de golpear suavemente la placa de 384 pocillos para que las gotas de gel quedaran planas en el fondo de los pocillos, la placa se colocó en una incubadora durante 30 minutos para permitir que las gotas de gel se solidificaran y se añadió medio BCO precalentado a 40 uL. /Bueno. A los pocillos de prueba de drogas, así como a los pocillos vacíos alrededor de los pocillos de control, se agregaron 40 uL de solución de PBS y se colocaron en una incubadora de dióxido de carbono para evitar que el líquido se evaporara y provocara que las gotas de gel se secaran.

Después de 3 días de incubación y observación, se realizó una observación microscópica del estado de la muestra en cada pocillo para el intercambio de fluido de medio volumen.

Diseñe el protocolo de prueba de sensibilidad a medicamentos de acuerdo con los requisitos de la siguiente tabla, configuró el grupo de control, el grupo en blanco y el grupo de prueba de medicamentos, el medicamento se disolvió de acuerdo con las instrucciones y se diluyó 4 veces en 6 concentraciones con medio organoide, respectivamente; Utilizando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes, el fármaco se probó a diferentes concentraciones: concentración semiinhibitoria (IC50), inhibición de células tumorales (IR), grado de desviación de la IC50 de la concentración sanguínea del fármaco, AUC (área bajo la dosis). -curva de respuesta), los criterios de evaluación de los resultados del ensayo de sensibilidad al fármaco toman IC50 e IR como índices principales, junto con el grado de desviación de IC50 de la concentración sanguínea del fármaco y los resultados del AUC como criterio auxiliar (para más detalles, consulte 3.10.3), evaluar los efectos sobre la supervivencia y proliferación de la clase de organismos, y dar orientación clínica sobre el uso del fármaco.

Tabla 1 Métodos para agrupar las pruebas de sensibilidad a los medicamentos Método de agrupación de las pruebas de sensibilidad a los medicamentos Grupo en blanco: sin organoide, sin fármaco añadido, 6 pocillos replicados por placa. Grupo de control: inoculado con organoides, sin exposición adicional a fármacos. Grupo de prueba de drogas: inoculado con organoide, agregue exposición a la droga. 3.1.4 Regímenes de combinación de medicamentos de quimioterapia Tabla 2 Medicamentos de quimioterapia de perfusión Gemcitabina □ Pirorubicina □ Epirubicina □ Silvestrol □ Adriamicina (doxorrubicina) □ 3.2 Sitio del estudio y población del estudio (fuente y criterios de exclusión de inclusión) Consulte el diseño del estudio para obtener más detalles 3.3 Variables (factores) y mediciones del estudio Lo positivo El grupo de control no fue sometido a cultivo de organoides ni a pruebas de sensibilidad a fármacos organoides.

Los pacientes restantes fueron sometidos a pruebas de sensibilidad a fármacos organoides de acuerdo con el protocolo de pruebas de sensibilidad a fármacos, utilizando un ensayo de viabilidad de células luminiscentes para probar la concentración semiinhibitoria (CI50) del fármaco, la tasa de inhibición (IR) de las células tumorales, el grado de desviación de la CI50 de la concentración sanguínea del fármaco y el AUC (el área bajo la curva dosis-respuesta) a diferentes concentraciones, y los criterios de evaluación de los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos se basaron en la CI50,IR como índices principales con la desviación IC50 de la concentración del fármaco en sangre, el AUC resulta como criterio auxiliar (ver 3.10.3 para más detalles), para evaluar su efecto sobre la supervivencia y proliferación de órganos de clase.

Los pacientes que se sometieron a cultivos de organoides y pruebas de sensibilidad a fármacos se sometieron a instilación de agentes quimioterapéuticos en la vejiga de acuerdo con la experiencia de los médicos. Los cinco fármacos perfundidos incluyeron gemcitabina, piroxicam, epirrubicina, mitomicina y adriamicina (doxorrubicina). Según la sensibilidad de sus fármacos de perfusión en la prueba de sensibilidad a fármacos organoides, se dividieron en el grupo de perfusión de fármacos sensibles a organoides y el grupo de perfusión de fármacos no sensibles a organoides. Régimen de perfusión: que incluye quimioterapia de perfusión de inducción (4 a 8 semanas después de la cirugía, 1 vez por semana, 4 veces en total) y quimioterapia de perfusión de mantenimiento (1 vez por mes, 11 veces en total).

Régimen de infusión de BCG: 6 infusiones de inducción seguidas de 3 infusiones de refuerzo una vez cada 2 semanas para mantener una buena respuesta inmunitaria, seguidas de 10 infusiones de mantenimiento una vez al mes para un total de 19 infusiones durante 1 año.

Mediciones clínicas: los dos grupos de pacientes en el grupo de perfusión de fármacos sensibles a organoides y el grupo de perfusión de fármacos no sensibles a organoides fueron seguidos y analizados para los criterios de valoración primarios y secundarios del estudio, y se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier unidireccional. comparar las diferencias en las tasas de recurrencia entre los dos grupos. El modelo de proporción de riesgo COX se utilizó para analizar la relación de riesgo de recurrencia del sexo, la edad, el estadio del tumor y el grado de los pacientes entre los dos grupos.

3.4 Resultados del estudio Se utilizaron los criterios RECIST1.1 para la evaluación de la eficacia, y los criterios de Choi y mRECIST se utilizaron como criterios auxiliares de evaluación de la eficacia.

Criterios de valoración principales del estudio: tasa de supervivencia libre de recurrencia del tumor a un año, tasa de supervivencia libre de recurrencia del tumor a tres años.

Criterios de valoración secundarios: tasa de supervivencia libre de progresión del tumor a un año, tasa de supervivencia libre de progresión del tumor a tres años.

3.5 Seguimiento Los dos grupos de pacientes en el grupo de perfusión de fármacos sensibles a órganos y el grupo de perfusión de fármacos no sensibles a órganos fueron seguidos y analizados para los criterios de valoración primarios y secundarios del estudio.

La cistoscopia es el método de elección al revisar pacientes con NMIBC y no existe una alternativa no invasiva a la cistoscopia. Por lo tanto, el seguimiento del NMIBC debe basarse en cistoscopia periódica. Si durante el examen se encuentran lesiones sospechosas de la mucosa de la vejiga, se debe realizar una biopsia para aclarar los hallazgos patológicos. Si es necesario, se realizan citología exfoliativa de orina, CT/CTU o MRI/MRU, pero ninguna de ellas puede reemplazar completamente la cistoscopia.

El plan de revisión de cistoscopia: el NMIBC de bajo riesgo se realiza una vez a los 3 meses y 12 meses después de la cirugía en el primer año, y posteriormente una vez al año hasta el tercer año; El NMIBC de riesgo intermedio se realiza una vez a los 3 meses, 6 meses y 12 meses después de la cirugía, cada 6 meses en el segundo año y posteriormente cada año hasta el tercer año; El NMIBC de alto riesgo se realiza cada 3 meses durante los primeros 2 años y posteriormente cada 6 meses hasta el tercer año.

3.6 Tamaño de la muestra Un tamaño de muestra de 293 casos fue suficiente para cumplir con los requisitos de los criterios de valoración del estudio.

Hubo 73 casos en el grupo de perfusión de fármacos no sensibles a organoides y 110 casos cada uno en el grupo de perfusión de fármacos sensibles a organoides y en el grupo de control positivo.

Base de cálculo:

1. Cálculo del tamaño de la muestra para el criterio de valoración del estudio de tasa de supervivencia libre de tumores a un año: se espera que la tasa de supervivencia libre de tumores a un año sea del 73 % en el grupo de infusión de fármacos sensibles a los organoides y del 50 % en el grupo no sensible a los organoides. grupo de infusión de fármacos, con unilateral α = 0,05, β = 0,2, y la relación entre los tamaños de muestra de los dos grupos es 1 (grupo experimental: grupo de control), los tamaños de muestra de los dos grupos son 55 casos en el grupo experimental, 55 casos en el grupo de control y 110 casos en el grupo de control positivo. 55 casos en el grupo de control, para un total de 110 casos, y considerando una eliminación del 20%, se requiere un tamaño de muestra total de 138 casos.
2. Calcule el tamaño de la muestra de acuerdo con el criterio de valoración del estudio de tasa de supervivencia libre de tumores a tres años: se espera que la tasa de supervivencia libre de tumores a tres años del grupo de infusión de fármacos sensibles a organoides sea del 63%, y los tres años La tasa de supervivencia libre de tumores al año del grupo de infusión de fármacos no sensibles a organoides será del 40%, y la unilateral α = 0,05, β = 0,2, y la relación entre los tamaños de muestra de los dos grupos será 1 (grupo experimental: grupo de control ), de modo que los tamaños de muestra de los dos grupos se calcularán como 58 casos en el grupo experimental, 58 casos en el grupo de control y 11 casos en el grupo de control, teniendo en cuenta el 20% de eliminación y un tamaño de muestra total de Se requerirán 138 casos. 58 casos en el grupo control, totalizando 116 casos, y considerando una excreción del 20%, se requirió un tamaño de muestra total de 146 casos.
3. Según los resultados de la literatura, la tasa de supervivencia libre de tumores a un año del grupo de control positivo es del 75%, y según la prueba previa, la tasa de supervivencia libre de tumores a un año del grupo de infusión de fármaco sensible a organoides Se espera que el grupo sea del 73%, y el valor de corte de no inferioridad es 0,2 (grupo de control-grupo experimental), y la relación entre los tamaños de muestra de los dos grupos es uno, siendo el alfa unilateral de 0,05 y el beta de 0,2. , el tamaño de la muestra de los dos grupos se calcula como 74 casos del grupo de infusión de fármacos sensibles a organoides, 74 casos del grupo de control positivo y un total de 116 casos del grupo experimental. 74 casos y 74 casos en el grupo de control positivo, para un total de 148 casos. Considerando una pérdida del 20%, el tamaño total de muestra requerido es de 186 casos.
4. Según los resultados de la literatura, la tasa de supervivencia libre de tumores a tres años del grupo de control positivo es del 65%, y según la prueba previa, la tasa de supervivencia libre de tumores a tres años del grupo de infusión de fármaco sensible a organoides Se espera que el grupo sea 63%, y el valor de corte de no inferioridad es 0,2 (grupo de control-grupo de prueba), y la relación entre los tamaños de muestra de los dos grupos es 1 si el alfa unilateral es 0,05 y el beta es 0,2, el tamaño de la muestra de los dos grupos se calcula como 88 casos del grupo de infusión de fármacos sensibles a organoides y 88 casos del grupo de control positivo. 88 casos y 88 casos en el grupo de control positivo, totalizando 176 casos, y teniendo en cuenta el 20% de eliminación, se requirió un tamaño de muestra total de 220 casos.

3.7 Diagrama de flujo de las técnicas de investigación Esta sección (imágenes) describe la ruta técnica del proyecto. 3.8 Recopilación y gestión de datos Los datos se recopilaron mediante observación y registro, y los datos originales se verificaron elemento por elemento para garantizar que coincidieran con los de los registros originales. Al final del experimento, se entregó al estadístico para su análisis estadístico.

3.9 Métodos de análisis estadístico Los datos medidos son generalmente estadísticas descriptivas con media, desviación estándar, mediana y valores mínimo y máximo. Para las variables categóricas se realizará estadística descriptiva según frecuencia y porcentaje.

Se aplicó el software estadístico SPSS para el análisis estadístico. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (x ± s), prueba t, ANOVA unidireccional (prueba post hoc de comparaciones de dos por dos utilizando el método LSD), se utilizó la prueba de chi-cuadrado para comparar tasas, y para los análisis de correlación se utilizó el método de Spearman. p < 0,05 se consideró que la diferencia era estadísticamente significativa.

3.10 Control de calidad 3.10.1 Resultados de inmunohistoquímica y tinción HE de órganos de clase Se ajustan a los resultados de las pruebas patológicas, lo que indica que las muestras de organoides y tumores construidas pueden conservar mejor la estabilidad patológica.

3.10.2 Análisis de organoides WES o RNA-Seq Las muestras de organoides y tumores construidas pueden conservar mejor la estabilidad genética. 3.10.3 Criterios de evaluación para los resultados de las pruebas de sensibilidad a los medicamentos El estándar de evaluación de los resultados de las pruebas de sensibilidad a los medicamentos tiene IC50,IR como índice principal, con el grado de desviación entre IC50 y la concentración del medicamento en sangre, los resultados del AUC como criterio auxiliar, cuando los índices sensibles IC50 e IR se cumplen al mismo tiempo, se considera sensible; cuando no es posible cumplir con el IC50, los índices IR al mismo tiempo, el IC50 combinado con el IC50 y la necesidad de concentrar la relación del menor grado de diferencia en los resultados de la sensibilidad.

3.10.3.1 Criterios de evaluación IC50. IC50>20× No sensible

1×<IC50≤20× Baja sensibilidad 0,5×<IC50≤1× Moderadamente sensible IC50≤0,5× altamente sensible El grupo sensible incluye fuertemente sensible y moderadamente sensible, y el grupo insensible incluye débilmente sensible y resistente.

3.10.3.2 "Criterios de evaluación de la tasa de inhibición tumoral IR". IR <30% es insensible y se clasifica como negativo; IR≥30% es sensible y se clasifica como positivo, en el cual 30%≤IR<50% es sensibilidad baja, 50%≤IR<70% es sensibilidad moderada y IR≥70% es sensibilidad alta.

Tasa de sensibilidad = número de casos con IR ≥ 30% / número total de casos en el grupo.

3.10.3.3 Cálculo del grado de desviación de la CI50 de la concentración sanguínea: el grado de desviación de la concentración sanguínea se refiere al grado de diferencia entre el valor CI50 obtenido de la prueba de sensibilidad al fármaco y la concentración sanguínea, y se calcula como CI50/concentración sanguínea.

Cuanto menor sea la proporción, más eficaz será el fármaco. 3.10.3.4 Criterios para la evaluación de los resultados del AUC (área bajo la curva de tiempo de fármaco): El cálculo específico del AUC generalmente implica la integración de la curva de concentración-tiempo.

El AUC está estrechamente relacionado con la relación dosis-respuesta. En la curva dosis-respuesta de eficacia de un fármaco, el AUC es un indicador compuesto del efecto general de un fármaco en un organismo entre la dosis y la respuesta. Un AUC mayor suele asociarse con un mejor efecto terapéutico.

3.11 Tratamiento de organoides posteriores al estudio Los organoides construidos con éxito en este estudio serán destruidos y eliminados uniformemente después del estudio de acuerdo con las normas de eliminación de desechos biomédicos.