Een onderzoeksprotocol voor het evalueren van de werkzaamheid van geperfuseerde chemotherapeutische middelen voor blaaskanker op basis van organoïdetechnologie

1. Achtergrond Blaaskanker is een kwaadaardige tumor die zijn oorsprong vindt in het uroepitheel van de blaas en die de eerste plaats inneemt in de incidentie van urogenitale tumoren in China. Onder hen is blaas-uro-epitheliale kanker de meest voorkomende, goed voor meer dan 90% van de blaaskankers. Op basis van de diepte van de tumorinvasie in de blaas en de prognostische kenmerken wordt blaaskanker klinisch geclassificeerd in niet-spierinvasieve blaaskanker (NMIBC) en spierinvasieve blaaskanker (MIBC), waarbij NMIBC het belangrijkste type is, verantwoordelijk voor ongeveer 75% van alle blaaskankerpatiënten.

   NMIBC wordt gewoonlijk behandeld met Transurethrale Resectie van Blaastumor (TURBt). Ondanks dat NMIBC zich in de vroege stadia van de ziekte bevindt, heeft het een hoog recidiefpercentage; uit onderzoeken blijkt dat het recidiefpercentage na vijf jaar ongeveer 70% bedraagt. Daarom is postoperatieve chemotherapie voor blaasperfusie een belangrijke therapeutische maatregel geworden om herhaling van blaaskanker te voorkomen. Al meer dan 60 jaar onderzoeken mensen effectievere geneesmiddelen en methoden voor blaasperfusie. In 1961 werd Thiotepa gebruikt voor blaasperfusietherapie en kreeg een zekere mate van werkzaamheid bij het voorkomen van het opnieuw optreden van oppervlakkige tumoren van de blaas. In 1976 geloofde Morales dat blaaskanker verband hield met immuundeficiënties, en dienovereenkomstig is BCG-blaasperfusietherapie buitengewoon succesvol geweest, waardoor een nieuwe manier van immunotherapie voor blaastumoren ontstond. , dat alom wordt gewaardeerd en nog steeds wordt beschouwd als het meest effectieve geneesmiddel voor blaasperfusie. BCG-instillatie kan echter ernstige bijwerkingen veroorzaken, waaronder urethrale en prostaatgranulomen, blaasirritatie, koorts, hematurie en andere lokale verschijnselen en systemische griepachtige symptomen, resulterend in intolerantie en onderbreking van de behandeling bij sommige patiënten, wat de brede klinische mogelijkheden heeft beperkt. toepassing van BCG. Studies hebben aangetoond dat intravesicale instillatie van chemotherapeutische middelen in de blaas het recidiefpercentage van oppervlakkige blaaskanker op de korte termijn met ongeveer 15%-20% en het recidiefpercentage op de lange termijn met ongeveer 6% kan verminderen. Momenteel zijn er veel keuzes aan chemotherapeutische middelen bij blaasinstillatie, waaronder (1) pirenzolubicine; (2) gemcitabine; (3) mitomycine; (4) epirubicine; (5) doxorubicine; (6) afwisselende chemotherapie via blaasinfusie met gemcitabine en pirenzolubicine; en (7) andere chemotherapieën met gecombineerde infusie. Vanwege de grote verscheidenheid aan chemotherapeutische geneesmiddelen is de selectie van geneesmiddelen echter grotendeels afhankelijk van klinische ervaring of bepaalde onderzoeksresultaten, bestaat er geen uniforme standaard en is deze blind, empirisch en gerandomiseerd. De Chinese richtlijnen voor diagnose en behandeling van urologische ziekten voorzagen ook niet in de selectie van perfusiemedicijnen, en individuele patiënten vertonen voor sommige chemotherapeutische medicijnen een natuurlijke weerstand. Wanneer de kliniek bepaalt dat de patiënt niet gevoelig is voor de toepassing van het medicijn, heeft het medicijn ernstige gevolgen gehad. toxische bijwerkingen, en zelfs leiden tot het fenomeen van resistentie tegen meerdere geneesmiddelen (resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, MDR), zodat het klinische recidiefpercentage nog steeds zo hoog is als 36% -44%, en tegelijkertijd de De tumor van deze groep patiënten vordert snel, waardoor de mogelijkheid verloren gaat om de behandelmethode opnieuw te selecteren. Daarom is het een hot spot geworden in het onderzoek naar chemotherapie voor blaasperfusie.

   De realisatie van precisietumortherapie hangt in grote mate af van de detectie van medicijngevoeligheid. Door middel van nauwkeurige geïndividualiseerde chemotherapeutische geneesmiddelenscreeningsexperimenten kan voor elke patiënt vóór aanvang van de behandeling het meest effectieve en minst toxische therapeutische regime worden beoordeeld, zodat een chemotherapeutisch regime voor een enkele patiënt kan worden voorgesteld. Dit is een nieuwe richting van onderzoek om de precisiebehandeling te realiseren van blaaskanker en om de efficiëntie van chemotherapie voor blaaskanker te verbeteren. Voorheen waren de meer algemeen gebruikte preklinische modellen traditionele tumorcellijnen en van mensen afkomstige xenotransplantaten van tumorweefsel (PDX). De kweekmethode voor tumorcellijnen is eenvoudig maar onvoldoende om de groeitoestand van tumorcellen bij patiënten te simuleren, en de geneesmiddelen die door het geneesmiddelenscreeningsysteem worden gescreend, hebben een lage waarde voor klinische toepassing. PDX, hoewel het in vivo tumorkenmerken kan simuleren en de tumor kan behouden. micro-omgeving, heeft duidelijke beperkingen zoals lage stabiele tumorigeniciteit, lange modellerings- en evaluatieperiode (een half jaar tot een jaar), tijdrovend en arbeidsintensief, en het is moeilijk te genereren en te gebruiken voor screening van geneesmiddelen met een hoge doorvoer. Daarom is de ontwikkeling van testmodellen voor geneesmiddelgevoeligheid die de heterogeniteit en complexiteit van blaaskanker kunnen nabootsen noodzakelijk geworden om meer gepersonaliseerde therapeutische en preventieve strategieën te ontwikkelen om het risico te minimaliseren en de effectiviteit van medische interventies te optimaliseren door zich te richten op de unieke genetische, omgevingsfactoren. en levensstijlkenmerken van individuen.

   Patiënt-afgeleide organoïden (PDO) zijn 3D-organoïdestructuren gevormd door in vitro zelf-geassembleerde stamcellen, die kunnen worden gedifferentieerd in meerdere orgaanspecifieke celtypen en cel-cel- en cel-omringende matrixinteracties en ruimtelijke locatiepatronen kunnen vertonen, waardoor in vitro enkele van de belangrijkste functies en structuren van echte organen, en met een stabiel fenotype. structuren met stabiele fenotypische en genetische kenmerken. Vergeleken met tweedimensionale tumorcellijnen en PDX kunnen tumororganoïden rechtstreeks worden gekweekt met behulp van de eigen weefsels van de patiënt, en tegelijkertijd kunnen deze organoïden enkele van de belangrijkste kenmerken van de primaire tumoren goed repliceren en de pathomorfologie en biologische mechanismen behouden. van de weefsels van de patiënt, en behoud van de heterogeniteit van de tumorweefsels en een meer realistische micro-omgeving van de tumor, evenals een korte groeicyclus. Het is nuttig voor het gebruik ervan bij klinische kankerpatiënten voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen voor radiotherapie, geneesmiddelen voor moleculaire targeting, antitumorantilichamen en andere geneesmiddelen, om de respons van de patiënt op geneesmiddelen te voorspellen, met het potentieel om te helpen bij klinische behandelingsbeslissingen.

   In 2018 rapporteerde Science een onderzoek naar het gebruik van metastatische maag-darmtumorachtige organen voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen, waarin de verschillen in gevoeligheid tussen 21 klinische patiënten en hun overeenkomstige BOB’s voor een reeks doelgerichte en chemotherapeutische geneesmiddelen vergelijkenderwijs werden geanalyseerd. sterke consistentie tussen de twee. In vergelijking met de daadwerkelijke patiëntuitkomsten waren de PDO’s goed voorspeld (gevoeligheid 100%, specificiteit 93%, positief voorspellende waarde 88% en negatief voorspellende waarde 100%).20 In 2020 construeerden Yao Y et al. 96 organoïden voor rectumkanker met behulp van biopsieën van 112 gevallen van lokaal gevorderde rectumkanker, en selecteerden er 80 om hun respons op radiotherapie te testen. De resultaten toonden aan dat organoïden voor rectumkanker gevoelig waren voor radiotherapie en de reactie van de patiënt. klinische reactie. De resultaten toonden aan dat de gevoeligheid van organoïden voor rectumkanker voor radiotherapie in hoge mate consistent was met de klinische respons van patiënten (gevoeligheid 78%, specificiteit 92%, nauwkeurigheid 84%). Vervolgens werd bij tumoren zoals maagkanker en borstkanker ook de overeenstemming gevonden tussen PDO en de reactie van tumorpatiënten op medicijnen. Yan HHN et al. construeerden een organoïdenbibliotheek voor maagkanker met behulp van tumorweefsels, paracancereuze weefsels en lymfekliermetastasen van 34 maagkankerpatiënten. Twee van hen ontwikkelden tumormetastasen en ondergingen na de operatie een combinatie van cisplatine en 5-FU, die beide goed reageerden. Het andere geval kreeg vóór de operatie chemotherapie en reageerde na de operatie niet op capecitabine. Onderzoek van de gevoeligheid van de overeenkomstige verbindingen van PDO in deze drie gevallen toonde aan dat de geneesmiddelgevoeligheid van PDO perfect overeenkwam met de klinische respons van elke patiënt. Guillen KP et al. construeerden PDX en PDO met behulp van tumormonsters van endocriene therapieresistente, recidiverende en gemetastaseerde borstkankerpatiënten, en deze monsters werden histomorfologisch, genomisch en medicijngevoeligheid onderzocht. De resultaten toonden aan dat zowel borstkanker-PDX als PDO de histobiologische en genomische eigenschappen van de brontumoren in hoge mate reduceerden, en beide consistent reageerden op antitumormedicijnen. Een patiënt met triple-negatieve borstkanker in stadium IIA in deze studie ontwikkelde levermetastasen ongeveer 1 jaar na het ondergaan van preoperatieve chemotherapie en chirurgische behandeling. De onderzoekers onderwierpen de constructen PDO en PDX aan ex vivo testen op de geneesmiddelgevoeligheid en ontdekten dat de microtubulusremmer eribuline het beste therapeutische effect had. Op basis van dit resultaat kregen patiënten de instructie een behandeling met eribuline te ondergaan, wat resulteerde in een volledige remissie van levermetastasen gedurende bijna 5 maanden na toediening. Deze onderzoeken bevestigen tot op zekere hoogte de mogelijkheid van PDO om de medicatie van patiënten met klinische tumoren te begeleiden. Er is ook aangetoond dat door het vergelijken van het verschil in reactie op geneesmiddelen tussen normaalachtige organen en PDO, is gebleken dat geneesmiddelen met een hoge selectiviteit helpen toxische bijwerkingen bij klinische patiënten te verminderen. Het is dus duidelijk dat het testen van de gevoeligheid voor medicijnen door PDO om het meest geschikte medicijnregime te ontdekken, zal helpen de klinische werkzaamheid van tumorpatiënten te verbeteren, de toxische bijwerkingen, het risico op medicijnresistentie en de kans op terugkeer van de tumor te verminderen, en de voordelen voor de patiënt te maximaliseren. patiënten.

   Daarom zullen we, op basis van van de patiënt afkomstige organoïdenmodellen voor blaaskanker, niet-spierinvasieve blaaskanker-perfusie-chemotherapie-testexperimenten voor de gevoeligheid van geneesmiddelen uitvoeren, een gestandaardiseerd testsysteem voor de gevoeligheid voor geneesmiddelen voor organoïden van blaaskanker opzetten en screeningstandaarden formuleren voor het testen van de gevoeligheid voor geneesmiddelen van organoïden van blaaskanker, om het optimale combinatieregime van geneesmiddelen te screenen, te helpen bij de klinische ontwikkeling van nieuwe geïndividualiseerde behandelingsprotocollen, en klinische validatie in meerdere centra uit te voeren om een ​​echte "vervangende medicijntest" te bereiken.

2. Onderzoeksvragen en doelstellingen Onderzoeksvragen: Deze studie vergelijkt de eenjarige tumorvrije recidiefoverleving met de driejaars tumorvrije recidiefoverleving van patiënten in de organoïde-gevoelige medicijninfusiegroep, de organoïde-ongevoelige medicijninfusiegroep, en de BCG-infusiegroep door middel van een cohortonderzoek, en het verschil in het recidiefpercentage tussen de drie groepen wordt vergeleken door middel van eenzijdige K-M-overlevingsanalyse. Beoordeling om de waarde van tumorachtige orgaangeneesmiddelgevoeligheidstesten te evalueren bij het begeleiden van individuele perfusie-chemotherapie voor blaaskanker.

   Onderzoeksdoel: het beoordelen van de toepassingswaarde van experimenten met gevoeligheid voor tumorachtige organen bij het begeleiden van individuele perfusiechemotherapie voor blaaskanker door de klinische werkzaamheid te observeren van de gevoeligheidsmethode voor tumorachtige organen bij het begeleiden van postoperatieve perfusiechemotherapie bij blaaskankerpatiënten.

   Zie Resultaatmetingen voor details

3. Onderzoeksmethodologie 3.1 Onderzoeksopzet Dit protocol is gebaseerd op de Technical Guidelines for Clinical Trials of Antineoplastic Drugs, en maakt gebruik van een multicenter cohortonderzoek.

3.1.1 Groepering Zie Groepen en Interventies voor details 3.1.2 Organoïde preparaat voor blaaskanker

1. Monstername van blaaskanker Het monsternameproces is in overeenstemming met de ziekenhuisethiek en ondertekende geïnformeerde toestemming. Bij patiënten die aan het experiment deelnemen, moet de pathologische diagnose blaaskanker worden gesteld, en de tumormonsters die operatief worden genomen moeten zoveel mogelijk groter zijn dan 0,8 cm*3, voor pathologische verificatie, organoïdekweek, testen op medicijngevoeligheid, enzovoort. Tumorweefsels moeten worden verzameld met aandacht voor weefselischemietijd en cryopreservatie, en de verzameltijd moet binnen 5 minuten liggen wanneer de weefsels uit de menselijke bloedcirculatie worden verwijderd, om stressnecrose van de tumorweefsels als gevolg van vroege hypoxie te voorkomen.
2. Voorbereiding van blaaskankerorganen Tijdens het proces van weefselverwerking werden fysieke vermaling en collagenase-vertering gebruikt om de weefselmonsters te verwerken, en de verwerkte en verteerde organoïden moesten vóór de kweek door celzeven van verschillende diameters worden gefilterd, om de verkregen organoïden te maken. uniform van omvang en vergemakkelijken de eenmaking van normen. Vervolgens werden ze in driedimensionale matrixgel geplant en in speciaal medium gekweekt.
3. Uitbreiding en kweek van blaaskankerorganoïden De groeistatus van de organoïden werd microscopisch waargenomen, en immunohistochemie en immunofluorescentie werden gebruikt om de organoïden te karakteriseren, de aanwezigheid van tumorcellen te bevestigen en hun morfologie te evalueren. Carcinoïde organen van blaaskanker werden gepasseerd en ingevroren.

3.1.3 Blaaskanker tumor organoïde medicijngevoeligheid testen. Na het observeren van het aantal organoïden onder de microscoop om het aantal te bereiken dat kan worden onderworpen aan medicijngevoeligheidstesten, werd het organoïde medium opgezogen en weggegooid. Voeg 3 ml spijsverteringsoplossing toe aan de petrischaal, blaas de druppels uit elkaar, verteer op 37 ℃, blaas de organoïden op en observeer onder de microscoop. Wanneer de organoïden zijn verteerd tot een homogene celmassa die 2-3 cellen bevat, voeg dan 2 maal de hoeveelheid toe. volume van de spijsverteringsoplossing om de spijsvertering te beëindigen. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 1500 rpm, zuig vervolgens het supernatant op en gooi het weg.

Resuspendeer de cellen met medium, probeer geen luchtbellen te produceren en verdun het medium tot gel in een verhouding van 1:1,5 en inoculeer vervolgens de gemengde gel met 10 uL/putje met een eenkanaalspipet in voorgekoelde platen met 384 putjes met 3.000 organoïden per putje (deze operatie werd uitgevoerd op ijs). Na het mengen van het medium met de gom in een verhouding van 1:1 (40 µl:40 µl), werd het medium als een blanco groep in de plaat met 384 putjes gedoseerd met een hoeveelheid van 10 µl/putje. Na voorzichtig tikken op de plaat met 384 putjes zodat de geldruppeltjes plat op de bodem van de putjes lagen, werd de plaat gedurende 30 minuten in een incubator geplaatst om de geldruppeltjes te laten stollen en werd voorverwarmd BCOs-medium toegevoegd tot 40 µl. /Goed. Aan de medicijntestputjes en aan de lege putjes rond de controleputjes werd 40 µl PBS-oplossing toegevoegd en in een kooldioxide-incubator geplaatst om te voorkomen dat de vloeistof verdampte en ervoor zorgde dat de geldruppels uitdroogden.

Na 3 dagen incubatie en observatie werd microscopische observatie van de status van het monster in elk putje uitgevoerd voor vloeistofuitwisseling met een half volume.

Ontwerp het medicijngevoeligheidstestprotocol volgens de vereisten van de volgende tabel, stel de controlegroep, blanco groep en medicijntestgroep in, het medicijn werd opgelost volgens de instructies en viervoudig verdund in 6 concentraties met respectievelijk organoïde medium; Met behulp van een luminescerende cellevensvatbaarheidstest werd het medicijn getest bij verschillende concentraties van de semi-remmende concentratie (IC50), remming van tumorcellen (IR), de mate van afwijking van de IC50 van de geneesmiddelconcentratie in het bloed, AUC (gebied onder de dosis -responscurve), nemen de evaluatiecriteria van de resultaten van de geneesmiddelgevoeligheidstest IC50 en IR als de belangrijkste indexen, samen met de mate van afwijking van IC50 van de geneesmiddelconcentratie in het bloed en de AUC-resultaten als hulpoordeel (voor details, zie 3.10.3), om de effecten op de overleving en proliferatie van de klasse van organismen te beoordelen, en om de klinische richtlijnen te geven voor het gebruik van het medicijn.

Tabel 1 Methoden voor het groeperen van tests op medicijngevoeligheid Groeperingsmethode voor testen op medicijngevoeligheid Lege groep: geen organoïde, geen medicijn toegevoegd, 6 replicawells per plaat. Controlegroep: ingeënt met organoïden, geen toegevoegde blootstelling aan medicijnen. Drugstestgroep: ingeënt met organoïde, voeg blootstelling aan medicijnen toe. 3.1.4 Combinatieregimes voor chemotherapie Tabel 2 Perfusiechemotherapie Gemcitabine □ Pirorubicine □ Epirubicine □ Silvestrol □ Adriamycine (doxorubicine) □ 3.2 Onderzoekslocatie en onderzoekspopulatie (bron en uitsluitingscriteria voor inclusie) Zie onderzoeksopzet voor details 3.3 Onderzoeksvariabelen (factoren) en metingen Het positieve controlegroep werd niet onderworpen aan organoïdekweek en ook niet aan testen op de gevoeligheid van organoïde geneesmiddelen.

De overige patiënten werden onderworpen aan testen op de gevoeligheid van organoïden voor geneesmiddelen in overeenstemming met het testprotocol voor de gevoeligheid voor geneesmiddelen, waarbij gebruik werd gemaakt van een luminescerende cellevensvatbaarheidstest om de semi-remmende concentratie (IC50) van het geneesmiddel, de remmingssnelheid (IR) van de tumorcellen, de mate van van de afwijking van de IC50 van de geneesmiddelconcentratie in het bloed, en de AUC (het gebied onder de dosis-responscurve) bij verschillende concentraties, en de evaluatiecriteria van de resultaten van het testen van de geneesmiddelgevoeligheid waren gebaseerd op de IC50,IR als de belangrijkste indexen met de IC50-afwijking van de geneesmiddelconcentratie in het bloed, resulteert de AUC als aanvullend oordeel (zie 3.10.3 voor details), om het effect ervan op de overleving en proliferatie van klassenorganen te beoordelen.

Patiënten die een organoïdecultuur en testen op geneesmiddelgevoeligheid ondergingen, ondergingen chemotherapeutische middelen in de blaas, volgens de ervaring van artsen. De vijf geperfundeerde geneesmiddelen omvatten gemcitabine, piroxicam, epirubicine, mitomycine en adriamycine (doxorubicine). Volgens de gevoeligheid van hun perfusiegeneesmiddelen in de gevoeligheidstest voor organoïde geneesmiddelen, werden ze verdeeld in een organoïde gevoelige geneesmiddelperfusiegroep en een organoïde niet-gevoelige geneesmiddelperfusiegroep. Perfusieregime: inclusief inductie-perfusiechemotherapie (4-8 weken na de operatie, 1 keer per week, 4 keer in totaal) en onderhoudsperfusiechemotherapie (1 keer per maand, 11 keer in totaal).

BCG-infusieschema: 6 inductie-infusies gevolgd door 3 booster-infusies eenmaal per 2 weken om een ​​goede immuunrespons te behouden, gevolgd door 10 onderhoudsinfusies eenmaal per maand, voor een totaal van 19 infusies over een periode van 1 jaar.

Klinische metingen: de twee groepen patiënten in de organoïde-gevoelige medicijnperfusiegroep en de organoïde-niet-gevoelige medicijnperfusiegroep werden gevolgd en geanalyseerd op de primaire en secundaire onderzoekseindpunten, en er werd een eenzijdige Kaplan-Meier-overlevingsanalyse uitgevoerd. om de verschillen in recidiefpercentages tussen de twee groepen te vergelijken. Het COX-risicoverhoudingsmodel werd gebruikt om de recidiefrisicoverhouding van het geslacht, de leeftijd, het tumorstadium en de graad van de patiënten tussen de twee groepen te analyseren.

3.4 Onderzoeksresultaten RECIST1.1-criteria werden gebruikt voor de evaluatie van de werkzaamheid, en Choi-criteria en mRECIST-criteria werden gebruikt als aanvullende evaluatiecriteria voor de werkzaamheid.

Primaire eindpunten van het onderzoek: één jaar tumor-recidiefvrije overlevingskans, drie jaar tumor-recidiefvrije overlevingskans.

Secundaire eindpunten: tumorprogressievrije overleving na één jaar, tumorprogressievrije overleving na drie jaar.

3.5 Follow-up De twee groepen patiënten in de orgaanachtige, gevoelige geneesmiddelperfusiegroep en de orgaanachtige, niet-gevoelige geneesmiddelperfusiegroep werden gevolgd en geanalyseerd op de primaire en secundaire onderzoekseindpunten.

Cystoscopie is de voorkeursmethode bij het beoordelen van patiënten met NMIBC en er is geen niet-invasief alternatief voor cystoscopie. Daarom moet de NMIBC-follow-up gebaseerd zijn op reguliere cystoscopie. Als tijdens het onderzoek verdachte laesies van het blaasslijmvlies worden gevonden, moet een biopsie worden uitgevoerd om de pathologische bevindingen op te helderen. Indien nodig worden urine-exfoliatieve cytologie, CT/CTU of MRI/MRU uitgevoerd, maar geen van deze kan cystoscopie volledig vervangen.

Het cystoscopiebeoordelingsplan: NMIBC met laag risico wordt één keer uitgevoerd 3 maanden en 12 maanden na de operatie in het eerste jaar, en daarna één keer per jaar tot het derde jaar; NMIBC met gemiddeld risico wordt eenmaal uitgevoerd na 3 maanden, 6 maanden en 12 maanden na de operatie, elke 6 maanden in het tweede jaar en daarna elk jaar tot het derde jaar; NMIBC met een hoog risico wordt de eerste twee jaar elke drie maanden uitgevoerd, en daarna elke zes maanden tot het derde jaar.

3.6 Steekproefomvang Een steekproefomvang van 293 gevallen was voldoende om aan de eisen voor de eindpunten van het onderzoek te voldoen.

Er waren 73 gevallen in de organoïde niet-gevoelige medicijnperfusiegroep en 110 gevallen elk in de organoïde gevoelige medicijnperfusiegroep en de positieve controlegroep.

Berekeningsbasis:

1. Berekening van de steekproefomvang voor het eindpunt van het onderzoek naar het eenjarige tumorvrije overlevingspercentage: het eenjarige tumorvrije overlevingspercentage zal naar verwachting 73% bedragen in de organoïde-gevoelige geneesmiddelinfusiegroep, en 50% in de organoïde-niet-gevoelige groep. geneesmiddelinfusiegroep, met eenzijdig α=0,05, β=0,2, en de verhouding van de steekproefomvang van de twee groepen is 1 (experimentele groep: controlegroep), de steekproefomvang van de twee groepen bedraagt ​​55 gevallen in de experimentele groep, 55 gevallen in de controlegroep en 110 gevallen in de positieve controlegroep. Met 55 gevallen in de controlegroep, in totaal 110 gevallen, en rekening houdend met een uitscheiding van 20%, is een totale steekproefomvang van 138 gevallen vereist.
2. Bereken de steekproefomvang op basis van het eindpunt van het driejarige tumorvrije overlevingspercentageonderzoek: er wordt verwacht dat het driejaars tumorvrije overlevingspercentage van de organoïde-gevoelige medicijninfusiegroep 63% zal zijn, en de driejarige tumorvrije overlevingskans van de organoïde-gevoelige medicijninfusiegroep zal naar verwachting 63% zijn. Het jaarlijkse tumorvrije overlevingspercentage van de organoïde-ongevoelige medicijninfusiegroep zal 40% zijn, en de unilaterale α=0,05, β=0,2, en de verhouding tussen de steekproefomvang van de twee groepen zal 1 zijn (experimentele groep: controlegroep ), zodat de steekproefomvang van de twee groepen wordt berekend als 58 gevallen in de experimentele groep, 58 gevallen in de controlegroep en 11 gevallen in de controlegroep, rekening houdend met 20% verlies, en een totale steekproefomvang van Er zijn 138 gevallen nodig. 58 gevallen in de controlegroep, in totaal 116 gevallen, en rekening houdend met 20% uitscheiding, was een totale steekproefomvang van 146 gevallen vereist.
3. Volgens de resultaten van de literatuur bedraagt ​​het tumorvrije overlevingspercentage na één jaar van de positieve controlegroep 75%, en volgens de pre-test het tumorvrije overlevingspercentage na één jaar van de organoïde-gevoelige medicijninfusie. De groep zal naar verwachting 73% bedragen, en de afkapwaarde voor non-inferioriteit is 0,2 (controlegroep-experimentele groep), en de verhouding tussen de steekproefomvang van de twee groepen is één, waarbij de unilaterale alfa 0,05 is en de bèta 0,2. , wordt de steekproefomvang van de twee groepen berekend als 74 gevallen van de organoïde-gevoelige medicijninfusiegroep, 74 gevallen van de positieve controlegroep en een totaal van 116 gevallen van de experimentele groep. 74 gevallen en 74 gevallen in de positieve controlegroep, voor een totaal van 148 gevallen. Rekening houdend met een uitscheiding van 20% bedraagt ​​de totale vereiste steekproefomvang 186 gevallen.
4. Volgens de resultaten van de literatuur bedraagt ​​het driejaars tumorvrije overlevingspercentage van de positieve controlegroep 65%, en volgens de pre-test het driejaars tumorvrije overlevingspercentage van de organoïde-gevoelige medicijninfusie. De verwachting is dat de groep naar verwachting 63% bedraagt, en de afkapwaarde voor non-inferioriteit 0,2 is (controlegroep-testgroep), en de verhouding tussen de steekproefomvang van de twee groepen 1 is als de unilaterale alfa 0,05 is en de bèta 0,05. 0,2 wordt de steekproefomvang van de twee groepen berekend als 88 gevallen van de organoïde-gevoelige medicijninfusiegroep en 88 gevallen van de positieve controlegroep. 88 gevallen en 88 gevallen in de positieve controlegroep, in totaal 176 gevallen, en rekening houdend met 20% uitscheiding, was een totale steekproefomvang van 220 gevallen vereist.

3.7 Stroomschema van onderzoekstechnieken Deze paragraaf (foto's) beschrijft het technische traject van het project. 3.8 Gegevensverzameling en -beheer Gegevens werden verzameld door observatie en registratie, en de originele gegevens werden item voor item gecontroleerd om er zeker van te zijn dat de gegevens consistent waren met die in de originele records. Aan het einde van het experiment werd het overgedragen aan de statisticus voor statistische analyse.

3.9 Statistische analysemethoden Gemeten gegevens zijn over het algemeen beschrijvende statistieken met gemiddelde, standaarddeviatie, mediaan, minimum- en maximumwaarden. Voor categorische variabelen zullen beschrijvende statistieken worden uitgevoerd op basis van frequentie en percentage.

Voor de statistische analyse werd statistische software SPSS toegepast. Meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (x ± s), t-test, one-way ANOVA (post hoc test twee-aan-twee vergelijkingen met behulp van de LSD-methode), chi-kwadraattest werd gebruikt voor vergelijking van tarieven, en de methode van Spearman werd gebruikt voor correlatieanalyses. p < 0,05 werd aangenomen dat het verschil statistisch significant was.

3.10 Kwaliteitscontrole 3.10.1 Klasse orgaan HE-kleuring en immunohistochemische resultaten Conform de pathologische testresultaten, wat aangeeft dat de geconstrueerde organoïde- en tumorspecimens de pathologische stabiliteit beter kunnen behouden.

3.10.2 Organoïde WES- of RNA-Seq-analyse Geconstrueerde organoïde- en tumorspecimens kunnen de genetische stabiliteit beter behouden. 3.10.3 Evaluatiecriteria voor testresultaten voor geneesmiddelgevoeligheid De evaluatiestandaard voor testresultaten voor geneesmiddelgevoeligheid heeft IC50,IR als de hoofdindex, met de mate van afwijking tussen IC50 en geneesmiddelconcentratie in het bloed, AUC-resultaten als aanvullend oordeel, wanneer de IC50, IR-gevoelige indexen tegelijkertijd wordt voldaan, wordt het als gevoelig beschouwd; wanneer het niet mogelijk is om aan de IC50 te voldoen, IR-indexen tegelijkertijd, IC50 gecombineerd met de IC50 en de noodzaak voor de concentratie van de verhouding van de kleinere mate van verschil in de resultaten van de gevoeligheid.

3.10.3.1 IC50-evaluatiecriteria. IC50>20× Niet gevoelig

1×<IC50≤20× Lage gevoeligheid 0,5×<IC50≤1× Matig gevoelige IC50≤0,5× hooggevoelig De gevoelige groep omvat sterk gevoelig en matig gevoelig, en de ongevoelige groep omvat zwak gevoelig en resistent.

3.10.3.2 Evaluatiecriteria voor het percentage IR-tumorremming. IR <30% is ongevoelig en geclassificeerd als negatief; IR≥30% is gevoelig en geclassificeerd als positief, waarbij 30%≤IR<50% lage gevoeligheid is, 50%≤IR<70% matige gevoeligheid en IR≥70% hoge gevoeligheid is.

Gevoeligheidsgraad = aantal gevallen met IR ≥ 30% / totaal aantal gevallen in de groep.

3.10.3.3 Berekening van de mate van afwijking van de IC50 van de bloedconcentratie: de mate van afwijking van de bloedconcentratie verwijst naar de mate van verschil tussen de IC50-waarde verkregen uit de geneesmiddelgevoeligheidstest en de bloedconcentratie, en wordt berekend als IC50/bloedconcentratie.

Hoe kleiner de verhouding, hoe effectiever het medicijn. 3.10.3.4 Criteria voor de evaluatie van de resultaten van de AUC (oppervlakte onder de geneesmiddel-tijdcurve): De specifieke berekening van de AUC omvat gewoonlijk de integratie van de concentratie-tijdcurve.

De AUC hangt nauw samen met de dosis-responsrelatie. In de dosis-responscurve van de werkzaamheid van geneesmiddelen is de AUC een samengestelde indicator van het totale effect van een geneesmiddel op een organisme tussen dosis en respons. Een grotere AUC gaat doorgaans gepaard met een beter therapeutisch effect.

3.11 Behandeling van organoïden na het onderzoek De organoïden die in dit onderzoek met succes zijn geconstrueerd, zullen na het onderzoek op uniforme wijze worden vernietigd en verwijderd in overeenstemming met de normen voor de verwijdering van biomedisch afval.