Výzkumný protokol pro hodnocení účinnosti perfundovaných chemoterapeutických látek pro rakovinu močového měchýře na základě technologie organoidů

1. Pozadí Rakovina močového měchýře je maligní nádor pocházející z uroepitelu močového měchýře, který představuje první místo ve výskytu nádorů urogenitálního traktu v Číně. Mezi nimi je nejčastější uroepiteliální karcinom močového měchýře, který představuje více než 90 % karcinomů močového měchýře. Podle hloubky invaze tumoru do močového měchýře a prognostických charakteristik je rakovina močového měchýře klinicky klasifikována na neinvazivní rakovinu močového měchýře (NMIBC) a svalově invazivní rakovinu močového měchýře (MIBC), přičemž hlavním typem je NMIBC. asi 75 % všech pacientů s rakovinou močového měchýře.

   NMIBC se obvykle léčí transuretrální resekcí tumoru močového měchýře (TURBt). Navzdory tomu, že je NMIBC v časných stádiích onemocnění, má vysokou míru recidivy, přičemž studie uvádějí 5letou míru recidivy přibližně 70 %. Proto se pooperační chemoterapie perfuze močového měchýře stala klíčovým terapeutickým opatřením k prevenci recidivy rakoviny močového měchýře. Již více než 60 let lidé zkoumají účinnější léky a metody pro perfuzi močového měchýře. určitý stupeň účinnosti při prevenci recidivy povrchových nádorů močového měchýře. V roce 1976 Morales věřil, že rakovina močového měchýře souvisí s imunitní nedostatečností, a proto byla BCG perfuzní terapie močového měchýře mimořádně úspěšná a vytvořila nový způsob imunoterapie nádorů močového měchýře , který byl široce ceněn a stále je považován za nejúčinnější lék na perfuzi močového měchýře. Instilace BCG však může způsobit závažné nežádoucí účinky, včetně uretrálních a prostatických granulomů, podráždění močového měchýře, horečky, hematurie a dalších lokálních projevů a systémových příznaků podobných chřipce, což má za následek nesnášenlivost a přerušení léčby u některých pacientů, což omezuje široké klinické aplikace BCG. Studie ukázaly, že intravezikální instilace chemoterapeutických látek do močového měchýře může snížit krátkodobou míru recidivy povrchového karcinomu močového měchýře asi o 15 % až 20 % a míru dlouhodobé recidivy asi o 6 %. V současné době existuje mnoho možností chemoterapeutických činidel při instilaci močového měchýře, včetně (1) pirenzolubicinu; (2) gemcitabin; (3) mitomycin; (4) epirubicin; (5) doxorubicin; (6) alternující chemoterapie infuze močového měchýře s gemcitabinem a pirenzolubicinem; a (7) jiné kombinované infuzní chemoterapie. Vzhledem k široké škále chemoterapeutických léků se však výběr léků většinou opírá o klinické zkušenosti nebo určité výsledky výzkumu, neexistuje jednotný standard a je slepý, empirický a randomizovaný. Čínské pokyny pro diagnostiku a léčbu urologických onemocnění také neposkytovaly výběr perfuzních léků a jednotliví pacienti na některá chemoterapeutika vykazují přirozenou rezistenci, když klinika určí, že pacient není citlivý na aplikaci léku, lék vyvolal závažnou toxické vedlejší účinky, a dokonce vedou k fenoménu multirezistence (multi-rezistence, MDR), takže klinická míra recidivy je stále až 36%-44% a současně nádor této skupiny pacientů rychle postupuje a ztrácí možnost znovu zvolit léčebnou metodu. Jak se tedy vyhnout selekci primárně rezistentních léků a přímo volit léky s vysokou citlivostí k dosažení individualizované chemoterapie, se stalo horkým místem ve výzkumu chemoterapie perfuze močového měchýře.

   Realizace precizní nádorové terapie velmi závisí na detekci lékové citlivosti. Prostřednictvím přesných individualizovaných experimentů screeningu chemoterapeutických léků lze u každého pacienta před zahájením léčby posoudit nejúčinnější a nejméně toxický terapeutický režim, takže navržení chemoterapeutického režimu pro jednoho pacienta je novým směrem výzkumu k realizaci přesné léčby. rakoviny močového měchýře a ke zlepšení účinnosti chemoterapie rakoviny močového měchýře. Dříve byly častěji používanými preklinickými modely tradiční nádorové buněčné linie a xenoimplantáty nádorové tkáně (PDX) odvozené od člověka. Metoda kultivace nádorových buněčných linií je jednoduchá, ale nedostatečná k simulaci růstového stavu nádorových buněk u pacientů a léky testované systémem screeningu léků mají nízkou hodnotu pro klinickou aplikaci. PDX, i když může simulovat charakteristiky nádoru in vivo a zachovat nádor mikroprostředí, má zjevná omezení, jako je nízká stabilní tumorigenicita, dlouhá modelovací a hodnotící doba (půl roku až jeden rok), časově náročná a pracná a je obtížné ji vytvořit a použít pro vysoce výkonný screening léčiv. Proto se vývoj modelů testů citlivosti na léky, které mohou napodobovat heterogenitu a složitost rakoviny močového měchýře, stal nezbytným, aby bylo možné vyvinout personalizovanější terapeutické a preventivní strategie pro minimalizaci rizika a optimalizaci účinnosti lékařských zásahů zaměřením na jedinečné genetické, environmentální a životní styl jednotlivců.

   Organoidy odvozené od pacienta (PDO) jsou 3D organoidní struktury tvořené kmenovými buňkami, které se samy sestavují in vitro, které lze diferencovat na více orgánově specifických buněčných typů a mohou vykazovat interakce mezi buňkami a buňkami a okolní matrice a vzory prostorového umístění, které obnovují in vitro některé z klíčových funkcí a struktur skutečných orgánů a mají stabilní fenotyp. struktur se stabilními fenotypovými a genetickými charakteristikami. Ve srovnání s dvourozměrnými nádorovými buněčnými liniemi a PDX mohou být nádorové organoidy kultivovány přímo pomocí pacientových vlastních tkání a zároveň mohou tyto organoidy dobře replikovat některé z klíčových charakteristik primárních nádorů, zachovat patomorfologii a biologické mechanismy tkání pacienta a zachovat heterogenitu nádorových tkání a realističtější nádorové mikroprostředí, stejně jako mít krátký růstový cyklus. Je užitečné pro jeho použití u pacientů s klinickým nádorovým onemocněním pro testování lékové citlivosti radioterapeutických léků, molekulárně cílených léků, protinádorových protilátek a dalších léků, k predikci reakce pacienta na léky s potenciálem pomoci při rozhodování o klinické léčbě.

   V roce 2018 Science oznámila studii o použití metastatických orgánů podobných gastrointestinálním nádorům pro testování citlivosti na léky, která komparativně analyzovala rozdíly v citlivosti mezi 21 klinickými pacienty a jejich odpovídajícími PDO na řadu cílených a chemoterapeutických léků, a výsledky ukázaly silná konzistence mezi těmito dvěma. Ve srovnání se skutečnými výsledky pacientů byly PDO dobře predikovány (senzitivita 100 %, specificita 93 %, pozitivní prediktivní hodnota 88 % a negativní prediktivní hodnota 100 %).20 V roce 2020 Yao Y et al zkonstruovali 96 organoidů rakoviny konečníku pomocí biopsií ze 112 případů lokálně pokročilého karcinomu konečníku a vybrali 80 z nich, aby otestovali jejich odpověď na radioterapii, a výsledky ukázaly, že organoidy rakoviny konečníku byly citlivé na radioterapii a pacientovu klinická odpověď. Výsledky ukázaly, že citlivost organoidů karcinomu rekta na radioterapii byla vysoce konzistentní s klinickou odpovědí pacientů (senzitivita 78 %, specificita 92 %, přesnost 84 %). Následně u nádorů, jako je rakovina žaludku a rakovina prsu, byla také zjištěna shoda mezi PDO a reakcí pacientů s nádorem na léky. Yan HHN et al zkonstruovali organoidní knihovnu rakoviny žaludku pomocí nádorových tkání, parakancerózních tkání a metastáz lymfatických uzlin od 34 pacientů s rakovinou žaludku. U dvou z nich se rozvinuly nádorové metastázy a po operaci podstoupili kombinaci cisplatiny a 5-FU, přičemž obě reagovaly dobře. Druhý případ dostával před operací chemoterapii a po operaci nereagoval na kapecitabin. Zkoumání citlivosti odpovídajících sloučenin PDO v těchto třech případech ukázalo, že léková senzitivita PDO byla v dokonalé shodě s klinickou odpovědí každého pacienta. Guillen KP et al zkonstruovali PDX a PDO s použitím vzorků nádorů z rezistentních na endokrinní terapii, pacientky s relabujícím a metastatickým karcinomem prsu a tyto vzorky byly vyšetřeny histomorfologicky, genomicky a citlivostí na léky. Výsledky ukázaly, že jak PDX rakoviny prsu, tak PDO byly vysoce redukující histobiologické a genomické vlastnosti svých zdrojových nádorů a obě konzistentně reagovaly na protinádorová léčiva. U pacientky s triple-negativním karcinomem prsu ve stadiu IIA v této studii vznikly jaterní metastázy asi 1 rok po prodělané předoperační chemoterapii a chirurgické léčbě. Výzkumníci podrobili konstrukty PDO a PDX ex vivo testování citlivosti na léčivo a zjistili, že inhibitor mikrotubulů eribulin má nejlepší terapeutický účinek. Na základě tohoto výsledku byli pacienti instruováni, aby podstoupili léčbu eribulinem, která vedla ke kompletní remisi jaterních metastáz po dobu téměř 5 měsíců po podání dávky. Tyto studie do jisté míry potvrzují možnost PDO řídit medikaci pacientů s klinickými nádory. Bylo také prokázáno, že porovnáním rozdílu v reakci na léky mezi orgány podobnými normálním a PDO bylo zjištěno, že léky s vysokou selektivitou pomáhají snižovat toxické vedlejší účinky u klinických pacientů. Je tedy jasné, že testování citlivosti na léky PDO za účelem zjištění nejvhodnějšího lékového režimu pomůže zlepšit klinickou účinnost pacientů s nádorem, snížit toxické vedlejší účinky, riziko rezistence vůči léku a pravděpodobnost recidivy nádoru a maximalizovat přínosy pacientů.

   S využitím organoidních modelů rakoviny močového měchýře odvozených od pacienta proto provedeme experimenty neinvazivní perfuzní chemoterapie rakoviny močového měchýře s testováním citlivosti na léky, zavedeme standardizovaný systém testování citlivosti na léky pro organoidy rakoviny močového měchýře a vytvoříme screeningové standardy pro testování citlivosti na léky. organoidy rakoviny močového měchýře, aby se prověřil optimální režim kombinace léků, napomohly klinickému vývoji nových individualizovaných léčebných protokolů a provedly se multicentrické klinické ověření za účelem dosažení skutečného „testování náhražek“.

2. Výzkumné otázky a cíle Výzkumné otázky: Tato studie porovnává jednoletou míru přežití bez tumoru a tříletou míru přežití bez tumoru u pacientů ve skupině s infuzí léků citlivých na organoidy, ve skupině s infuzemi léků necitlivých na organoidy, a skupině s BCG infuzí pomocí kohortové studie a rozdíl v míře recidivy mezi těmito třemi skupinami se porovnává pomocí jednosměrné analýzy přežití K-M. Posouzení k vyhodnocení hodnoty testů citlivosti orgánů podobných nádoru na léky při vedení individuální perfuzní chemoterapie rakoviny močového měchýře.

   Cíl výzkumu: zhodnotit aplikační hodnotu experimentů senzitivity na léky na orgánech podobných nádoru při vedení individuální perfuzní chemoterapie u rakoviny močového měchýře sledováním klinické účinnosti metody lékové citlivosti na orgány podobné nádoru při vedení pooperační perfuzní chemoterapie u pacientů s rakovinou močového měchýře.

   Podrobnosti viz Měření výsledků

3. Metodika výzkumu 3.1 Uspořádání studie Tento protokol je založen na Technických pokynech pro klinické studie antineoplastických léků a využívá multicentrickou kohortovou studii.

3.1.1 Seskupování Podrobnosti viz Skupiny a intervence 3.1.2 Organoidní přípravek na rakovinu močového měchýře

1. Odběr vzorků rakoviny močového měchýře Proces odběru vzorků je v souladu s nemocniční etikou a podepsaným informovaným souhlasem. Pacienti zařazení do experimentu musí být patologicky diagnostikováni s rakovinou močového měchýře a velikost vzorků nádoru odebraných chirurgicky by měla být pokud možno větší než 0,8 cm*3 pro patologické ověření, kultivaci organoidů, test citlivosti na léky atd. Nádorové tkáně by měly být odebírány s ohledem na dobu tkáňové ischemie a kryokonzervace a doba odběru by měla být do 5 minut, když jsou tkáně odstraněny z lidského krevního oběhu, aby se zabránilo stresové nekróze nádorových tkání v důsledku časné hypoxie.
2. Příprava orgánů pro rakovinu močového měchýře V procesu zpracování tkáně se ke zpracování vzorků tkáně použilo fyzické drcení a štěpení kolagenázou a zpracované a natrávené organoidy bylo nutné před kultivací filtrovat přes buněčná síta různých průměrů, aby se získaly organoidy jednotné velikosti a usnadňují sjednocení norem. Poté byly zasazeny do trojrozměrného matricového gelu a kultivovány ve speciálním médiu.
3. Expanze a kultivace organoidů rakoviny močového měchýře Stav růstu organoidů byl pozorován mikroskopicky a imunohistochemie a imunofluorescence byly použity k charakterizaci organoidů, potvrzení přítomnosti nádorových buněk a hodnocení jejich morfologie. Karcinoidní orgány rakoviny močového měchýře byly pasážovány a zmraženy.

3.1.3 Testování citlivosti organoidů na léčivo s rakovinou močového měchýře Po pozorování počtu organoidů pod mikroskopem k dosažení počtu, který lze podrobit testování citlivosti na léčivo, bylo organoidní médium odsáto a zlikvidováno. Přidejte 3 ml trávicího roztoku do Petriho misky, rozfoukejte kapičky, štěpte při 37 °C, profoukněte organoidy a pozorujte pod mikroskopem, když jsou organoidy natráveny na homogenní buněčnou hmotu obsahující 2-3 buňky, přidejte 2násobek objem trávicího roztoku k ukončení trávení. 1500 ot./min., centrifugujte buňky po dobu 3 minut a poté odsajte a zlikvidujte supernatant.

Resuspendujte buňky v médiu, snažte se nevytvářet vzduchové bubliny a nařeďte médium na gel v poměru 1:1,5, poté naočkujte smíchaný gel v množství 10 ul/jamku jednokanálovou pipetou do předem vychlazených 384jamkových destiček s 3000 organoidy na jamku (tato operace byla provedena na ledu). Po smíchání média s gumou v poměru 1:1 (40 ul:40 ul) bylo médium rozděleno do 384jamkové destičky v množství 10 ul/jamku jako slepá skupina. Po jemném poklepání na 384jamkovou destičku tak, aby gelové kapky ležely naplocho na dně jamek, byla destička umístěna do inkubátoru na 30 minut, aby gelové kapičky ztuhly, a bylo přidáno předehřáté médium BCOs v množství 40 ul. /dobře. Do jamek pro test na léčivo stejně jako do prázdných jamek kolem kontrolních jamek bylo přidáno 40 ul roztoku PBS a umístěno do inkubátoru s oxidem uhličitým, aby se zabránilo odpařování kapaliny a vysychání gelových kapek.

Po 3 dnech inkubace a pozorování bylo provedeno mikroskopické pozorování stavu vzorku v každé jamce pro výměnu polovičního objemu tekutiny.

Navrhněte protokol testu citlivosti na léčivo podle požadavků následující tabulky, sestavte kontrolní skupinu, slepou skupinu a skupinu pro test na léčivo, léčivo bylo rozpuštěno podle pokynů a naředěno 4krát na 6 koncentrací organoidním médiem; pomocí testu životaschopnosti luminiscenčních buněk bylo léčivo testováno při různých koncentracích semi-inhibiční koncentrace (IC50), inhibici nádorových buněk (IR), stupni odchylky IC50 od koncentrace léčiva v krvi, AUC ( plocha pod dávkou -křivka odezvy), hodnotící kritéria výsledků testu citlivosti na léčivo berou jako hlavní indexy IC50 a IR spolu se stupněm odchylky IC50 od koncentrace léčiva v krvi a výsledky AUC jako pomocné posouzení (pro podrobnosti viz 3.10.3), zhodnotit účinky na přežití a proliferaci třídy organismů a poskytnout klinické pokyny pro použití léku.

Tabulka 1 Metody seskupování testů citlivosti na léčivo Způsob seskupování testů citlivosti na léčivo Slepá skupina: Bez organoidů, bez přidaného léčiva, 6 jamek na destičku. Kontrolní skupina: Inokulovaná organoidy, bez přidané expozice léku. Drogová testovací skupina: Naočkovaná organoidy, přidat expozici drogám. 3.1.4 Režimy kombinace léků pro chemoterapii Tabulka 2 Léky pro perfuzní chemoterapii Gemcitabin □ Pirorubicin □ Epirubicin □ Silvestrol □ Adriamycin (doxorubicin) □ 3.2 Místo studie a studovaná populace (zdroj a kritéria vyloučení) Podrobnosti viz design studie 3.3 Proměnné studie Pozitivní ukazatele (F) kontrolní skupina nebyla podrobena kultivaci organoidů ani testování citlivosti na organoidy.

Zbývající pacienti byli podrobeni testování citlivosti na organoidy v souladu s protokolem testování citlivosti na léčivo, s použitím testu životaschopnosti luminiscenčních buněk k testování semi-inhibiční koncentrace (IC50) léčiva, rychlosti inhibice (IR) nádorových buněk, stupně odchylky IC50 od koncentrace léku v krvi a AUC (plocha pod křivkou dávka-odezva) při různých koncentracích a hodnotící kritéria výsledků testování citlivosti na lék byly založeny na IC50,IR jako hlavních indexech s odchylkou IC50 od koncentrace léku v krvi je výsledkem AUC jako pomocné posouzení (viz 3.10.3 pro podrobnosti), k posouzení jeho vlivu na přežití a proliferaci třídních orgánů.

Pacienti, kteří podstoupili kultivaci organoidů a testování citlivosti na léky, podstoupili instilaci chemoterapeutik do močového měchýře podle zkušeností klinických lékařů. Pět perfundovaných léků zahrnovalo gemcitabin, piroxicam, epirubicin, mitomycin a adriamycin (doxorubicin). Podle citlivosti jejich perfuzních léků v testu citlivosti na organoidy byli rozděleni na skupinu perfuzní perfuze senzitivních na organoidy a skupinu perfuze na organoidy necitlivé na léky. Perfuzní režim: včetně indukční perfuzní chemoterapie (4-8 týdnů po operaci, 1krát týdně, celkem 4krát) a udržovací perfuzní chemoterapie (1krát za měsíc, celkem 11krát).

Režim infuze BCG: 6 indukčních infuzí následovaných 3 posilovacími infuzemi jednou za 2 týdny k udržení dobré imunitní odpovědi, následovaných 10 udržovacími infuzemi jednou měsíčně, celkem 19 infuzí za 1 rok.

Klinická měření: dvě skupiny pacientů ve skupině s perfuzí na organoidy citlivé a ve skupině s perfuzí na organoidy necitlivé na léčivo byly sledovány a analyzovány na primární a sekundární cílové parametry studie a byla provedena jednocestná Kaplan-Meierova analýza přežití porovnat rozdíly v míře recidivy mezi těmito dvěma skupinami. Model podílu rizika COX byl použit k analýze poměru rizika recidivy pacientů podle pohlaví, věku, stadia nádoru a stupně mezi těmito dvěma skupinami.

3.4 Výsledky studie Pro hodnocení účinnosti byla použita kritéria RECIST1.1 a jako pomocná kritéria hodnocení účinnosti byla použita kritéria Choi a kritéria mRECIST.

Primární cílové parametry studie: jednoleté přežití bez recidivy tumoru, tříleté přežití bez recidivy tumoru.

Sekundární cílové parametry: jednoleté přežití bez progrese tumoru, tříleté přežití bez progrese tumoru.

3.5 Sledování Dvě skupiny pacientů ve skupině s orgánově citlivým perfúzním lékem a orgánovým necitlivým perfúzním lékem byly sledovány a analyzovány na primární a sekundární koncové body studie.

Cystoskopie je metodou volby při kontrole pacientů s NMIBC a neexistuje žádná neinvazivní alternativa k cystoskopii. Proto by sledování NMIBC mělo být založeno na pravidelné cystoskopii. Pokud jsou při vyšetření zjištěny podezřelé léze sliznice močového měchýře, je třeba provést biopsii k objasnění patologického nálezu. V případě potřeby se provádí exfoliativní cytologie moči, CT/CTU nebo MRI/MRU, ale žádný z nich nemůže zcela nahradit cystoskopii.

Plán kontroly cystoskopie: NMIBC s nízkým rizikem se provádí jednou 3 měsíce a 12 měsíců po operaci v 1. roce a poté jednou ročně až do 3. roku; NMIBC se středním rizikem se provádí jednou za 3 měsíce, 6 měsíců a 12 měsíců po operaci, každých 6 měsíců ve 2. roce a poté každý rok až do 3. roku; vysoce rizikové NMIBC se provádí každé 3 měsíce v prvních 2 letech a poté každých 6 měsíců až do 3. roku.

3.6 Velikost vzorku Velikost vzorku 293 případů byla dostatečná ke splnění požadavků na koncové body studie.

Bylo 73 případů ve skupině s perfuzí léčiva necitlivé na organoidy a 110 případů ve skupině perfuze na léčivo citlivé na organoidy a ve skupině s pozitivní kontrolou.

Základ výpočtu:

1. Výpočet velikosti vzorku pro cílový bod studie míry jednoročního přežití bez nádoru: míra přežití jednoho roku bez nádoru se očekává 73 % ve skupině s infuzí léků citlivých na organoidy a 50 % ve skupině s necitlivostí na organoidy skupina s infuzí léčiva, s jednostranným α=0,05, β=0,2 a poměr velikostí vzorků obou skupin je 1 (experimentální skupina: kontrolní skupina), velikost vzorku dvou skupin je 55 případů v experimentální skupině, 55 případů v kontrolní skupině a 110 případů v pozitivní kontrolní skupině. 55 případů v kontrolní skupině, celkem 110 případů, as ohledem na 20% vyřazení je požadována celková velikost vzorku 138 případů.
2. Vypočítejte velikost vzorku podle koncového bodu tříleté studie míry přežití bez nádoru: očekává se, že míra tříletého přežití bez nádoru u skupiny s infuzí léků citlivých na organoidy bude 63 % a tříleté přežití bez nádoru roční míra přežití bez nádoru ve skupině s infuzí léčiva necitlivého na organoidy bude 40 % a jednostranné α=0,05, β=0,2 a poměr velikostí vzorků těchto dvou skupin bude 1 (experimentální skupina: kontrolní skupina ), takže velikost vzorku obou skupin bude vypočtena jako 58 případů v experimentální skupině, 58 případů v kontrolní skupině a 11 případů v kontrolní skupině, přičemž se vezme v úvahu 20% prolévání a celková velikost vzorku Bude vyžadováno 138 případů. 58 případů v kontrolní skupině, celkem 116 případů, as ohledem na 20% vyřazení, byla požadována celková velikost vzorku 146 případů.
3. Podle výsledků literatury je roční míra přežití bez nádoru pozitivní kontrolní skupiny 75 % a podle předtestu roční míra přežití bez nádoru infuze léku citlivého na organoidy. očekává se, že skupina bude 73 % a hraniční hodnota non-inferiority je 0,2 (kontrolní skupina-experimentální skupina) a poměr velikostí vzorků těchto dvou skupin je jedna, přičemž jednostranné alfa je 0,05 a beta 0,2 , velikost vzorku dvou skupin je vypočtena jako 74 případů skupiny s infuzí léčiv citlivých na organoidy, 74 případů pozitivní kontrolní skupiny a celkem 116 případů experimentální skupiny. 74 případů a 74 případů v pozitivní kontrolní skupině, celkem 148 případů. Při uvážení 20% prolévání je celková požadovaná velikost vzorku 186 případů.
4. Podle výsledků literatury je tříleté přežití bez nádoru u pozitivní kontrolní skupiny 65 % a podle předtestu tříleté přežití bez nádoru u infuze léku citlivého na organoidy. očekává se, že skupina bude 63 % a hraniční hodnota non-inferiority je 0,2 (kontrolní skupina-testovaná skupina) a poměr velikostí vzorku obou skupin je 1, pokud jednostranné alfa je 0,05 a beta je 0,2, velikost vzorku dvou skupin se vypočítá jako 88 případů ve skupině s infuzí léčiv citlivých na organoidy a 88 případů ve skupině s pozitivní kontrolou. 88 případů a 88 případů v pozitivní kontrolní skupině, celkem 176 případů, a při zohlednění 20% vylučování byla požadována celková velikost vzorku 220 případů.

3.7 Vývojový diagram výzkumných technik Tato část (obrázky) popisuje technickou cestu projektu. 3.8 Sběr a správa dat Údaje byly shromažďovány pozorováním a zaznamenáváním a původní údaje byly kontrolovány položku po položce, aby bylo zajištěno, že údaje jsou konzistentní s údaji v původních záznamech. Na konci experimentu byl předán statistikovi ke statistické analýze.

3.9 Metody statistické analýzy Naměřená data jsou obecně popisné statistiky s průměrem, směrodatnou odchylkou, mediánem, minimální a maximální hodnotou. U kategoriálních proměnných bude provedena popisná statistika podle četnosti a procenta.

Pro statistickou analýzu byl použit statistický software SPSS. Naměřená data byla vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka (x ± s), t-test, jednocestná ANOVA (post hoc test two-by-dva srovnání s použitím metody LSD), pro srovnání rychlostí byl použit chí-kvadrát test, a Spearmanova metoda byla použita pro korelační analýzy. p < 0,05 bylo považováno za statisticky významný rozdíl.

3.10 Kontrola kvality 3.10.1 Výsledky barvení HE třídy orgánů a výsledky imunohistochemie Shodují se s výsledky patologických testů, což naznačuje, že zkonstruované vzorky organoidů a nádorů si mohou lépe zachovat patologickou stabilitu.

3.10.2 Analýza organoidního WES nebo RNA-Seq Zkonstruované vzorky organoidů a nádorů si mohou lépe zachovat genetickou stabilitu. 3.10.3 Hodnotící kritéria pro výsledky testů citlivosti na léky Hodnotící standard výsledků testu citlivosti na léky má jako hlavní index IC50,IR, se stupněm odchylky mezi IC50 a koncentrací léku v krvi, výsledky AUC jako pomocný úsudek, když indexy IC50, IR senzitivity jsou splněny současně, je považováno za citlivé; kdy není možné splnit současně IC50, IR indexy, IC50 kombinované s IC50 a potřeba koncentrace poměru menšího stupně rozdílu ve výsledcích citlivosti.

3.10.3.1 Kritéria hodnocení IC50. IC50>20× Není citlivý

1×<IC50≤20× Nízká citlivost 0,5×<IC50≤1× Středně citlivá IC50≤0,5× vysoce citlivé Mezi citlivé skupiny patří silně citlivé a středně citlivé a mezi necitlivé patří slabě citlivé a odolné.

3.10.3.2 Kritéria hodnocení pro rychlost inhibice nádoru IR. IR <30 % je necitlivé a klasifikované jako negativní; IR ≥ 30 % je citlivé a klasifikované jako pozitivní, ve kterém 30 % ≤ IR < 50 % je nízká citlivost, 50 % ≤ IR < 70 % je střední citlivost a IR ≥ 70 % je vysoká citlivost.

Míra citlivosti = počet případů s IR ≥ 30 % / celkový počet případů ve skupině.

3.10.3.3 Výpočet stupně odchylky IC50 od koncentrace v krvi: stupeň odchylky od koncentrace v krvi se týká stupně rozdílu mezi hodnotou IC50 získanou z testu citlivosti na léčivo a koncentrací v krvi a vypočítá se jako IC50/koncentrace v krvi.

Čím menší je poměr, tím účinnější je lék. 3.10.3.4 Kritéria pro hodnocení výsledků AUC (plocha pod křivkou lék-čas): Specifický výpočet AUC obvykle zahrnuje integraci křivky koncentrace-čas.

AUC úzce souvisí se vztahem dávka-odpověď. V křivce účinnosti léčiva na dávce-odezva je AUC složeným indikátorem celkového účinku léčiva na organismus mezi dávkou a odpovědí. Větší AUC je obvykle spojena s lepším terapeutickým účinkem.

3.11 Post-studijní ošetření organoidů Organoidy úspěšně zkonstruované v této studii budou po studii jednotně zničeny a zlikvidovány v souladu s normami pro likvidaci biomedicínského odpadu.