Um protocolo de pesquisa para avaliar a eficácia de agentes quimioterápicos perfundidos para câncer de bexiga com base na tecnologia organoide

1. Antecedentes O câncer de bexiga é um tumor maligno originado do uroepitélio da bexiga, responsável pelo primeiro lugar na incidência de tumores geniturinários na China. Entre eles, o cancro uroepitelial da bexiga é o mais comum, representando mais de 90% dos cancros da bexiga. De acordo com a profundidade da invasão do tumor na bexiga e as características prognósticas, o câncer de bexiga é clinicamente classificado em câncer de bexiga não invasivo aos músculos (NMIBC) e câncer de bexiga invasivo aos músculos (MIBC), sendo o NMIBC o tipo principal, sendo responsável por cerca de 75% de todos os pacientes com câncer de bexiga.

   O NMIBC geralmente é tratado com ressecção transuretral de tumor de bexiga (RTU). Apesar de estar nos estágios iniciais da doença, o NMIBC apresenta uma alta taxa de recorrência, com estudos relatando uma taxa de recorrência em 5 anos de aproximadamente 70% . Portanto, a quimioterapia de perfusão vesical pós-operatória tornou-se uma medida terapêutica fundamental para prevenir a recorrência do câncer de bexiga. Por mais de 60 anos, as pessoas têm explorado medicamentos e métodos de perfusão vesical mais eficazes. um certo grau de eficácia na prevenção da recorrência de tumores superficiais da bexiga. Em 1976, Morales acreditava que o câncer de bexiga estava relacionado a deficiências imunológicas e, consequentemente, a terapia de perfusão de bexiga BCG foi extremamente bem-sucedida, criando uma nova forma de imunoterapia para tumores de bexiga. , que tem sido amplamente valorizado e ainda é considerado o medicamento de perfusão vesical mais eficaz. Contudo, a instilação de BCG pode causar efeitos secundários graves, incluindo granulomas uretrais e prostáticos, irritação da bexiga, febre, hematúria e outras manifestações locais e sintomas sistémicos semelhantes aos da gripe, resultando em intolerância e interrupção do tratamento em alguns pacientes, o que tem limitado o amplo quadro clínico. aplicação do BCG. Estudos demonstraram que a instilação intravesical de agentes quimioterapêuticos na bexiga pode reduzir a taxa de recorrência a curto prazo do cancro superficial da bexiga em cerca de 15%-20% e a taxa de recorrência a longo prazo em cerca de 6%. Atualmente existem muitas opções de agentes quimioterápicos para instilação na bexiga, incluindo (1) pirenzolubicina; (2) gencitabina; (3) mitomicina; (4) epirrubicina; (5) doxorrubicina; (6) quimioterapia de infusão vesical alternada com gencitabina e pirenzolubicina; e (7) outras quimioterapias de infusão combinada. No entanto, devido à grande variedade de medicamentos quimioterápicos, a seleção de medicamentos depende principalmente da experiência clínica ou de determinados resultados de pesquisas, não existe um padrão uniforme e é cega, empírica e randomizada. As diretrizes chinesas de diagnóstico e tratamento de doenças urológicas também não forneceram a seleção de medicamentos de perfusão, e pacientes individuais para alguns quimioterápicos apresentam resistência natural, quando a clínica determina que o paciente não é sensível à aplicação do medicamento, o medicamento produziu graves efeitos colaterais tóxicos, e até mesmo levar ao fenômeno de resistência a múltiplos medicamentos (resistência a múltiplos medicamentos, MDR) produzido, de modo que a clínica A taxa de recorrência ainda é tão alta quanto 36% -44%, e ao mesmo tempo, o o tumor desse grupo de pacientes progride rapidamente, perdendo a oportunidade de re-selecionar o método de tratamento. Portanto, como evitar a seleção de medicamentos primários resistentes a medicamentos e escolher diretamente medicamentos com alta sensibilidade para obter quimioterapia individualizada tornou-se um ponto quente na pesquisa de quimioterapia de perfusão vesical.

   A realização da terapia tumoral de precisão depende muito da detecção da sensibilidade ao medicamento. Através de experimentos precisos e individualizados de triagem de quimioterápicos, o regime terapêutico mais eficaz e menos tóxico pode ser avaliado para cada paciente antes do início do tratamento, de modo que propor um regime quimioterápico para um único paciente é uma nova direção de pesquisa para realizar o tratamento de precisão do cancro da bexiga e melhorar a eficiência da quimioterapia do cancro da bexiga. Anteriormente, os modelos pré-clínicos mais comumente usados ​​eram linhas celulares tumorais tradicionais e xenoenxertos de tecido tumoral de origem humana (PDX). O método de cultura de linha celular tumoral é simples, mas insuficiente para simular o estado de crescimento das células tumorais em pacientes, e os medicamentos selecionados por seu sistema de triagem de medicamentos têm baixo valor para aplicação clínica.PDX, embora possa simular características tumorais in vivo e preservar o tumor microambiente, tem limitações óbvias, como tumorigenicidade estável baixa, longo período de modelagem e avaliação (meio ano a um ano), demorado e trabalhoso, e é difícil de gerar e usar para triagem de medicamentos de alto rendimento. Portanto, o desenvolvimento de modelos de ensaio de sensibilidade a medicamentos que possam imitar a heterogeneidade e a complexidade do câncer de bexiga tornou-se necessário, a fim de desenvolver estratégias terapêuticas e preventivas mais personalizadas para minimizar o risco e otimizar a eficácia das intervenções médicas, visando as características genéticas, ambientais únicas. e características de estilo de vida dos indivíduos.

   Organoides derivados de pacientes (PDO) são estruturas organoides 3D formadas por células-tronco automontadas in vitro, que podem ser diferenciadas em vários tipos de células específicas de órgãos e podem exibir interações de matriz célula-célula e células circundantes e padrões de localização espacial, recriando in vitro algumas das principais funções e estruturas de órgãos reais e com um fenótipo estável. estruturas com características fenotípicas e genéticas estáveis. Em comparação com linhas celulares tumorais bidimensionais e PDX, os organoides tumorais podem ser cultivados diretamente usando os próprios tecidos do paciente e, ao mesmo tempo, esses organoides podem replicar bem algumas das principais características dos tumores primários, reter a patomorfologia e os mecanismos biológicos dos tecidos do paciente, além de preservar a heterogeneidade dos tecidos tumorais e um microambiente tumoral mais realista, além de possuir um ciclo de crescimento curto. É útil para seu uso em pacientes clínicos com câncer para testes de sensibilidade a medicamentos de radioterapia, medicamentos de direcionamento molecular, anticorpos antitumorais e outros medicamentos, para prever a resposta do paciente aos medicamentos, com potencial para auxiliar nas decisões de tratamento clínico.

   Em 2018, a Science relatou um estudo sobre o uso de órgãos semelhantes a tumores gastrointestinais metastáticos para testes de sensibilidade a medicamentos, que analisou comparativamente as diferenças de sensibilidade entre 21 pacientes clínicos e seus PDOs correspondentes a uma série de medicamentos direcionados e quimioterápicos, e os resultados mostraram forte consistência entre os dois. Em comparação com os resultados reais dos pacientes, os PDOs foram bem previstos (sensibilidade 100%, especificidade 93%, valor preditivo positivo 88% e valor preditivo negativo 100%).20 Em 2020, Yao Y et al construíram 96 organoides de câncer retal usando biópsias de 112 casos de câncer retal localmente avançado e selecionaram 80 deles para testar sua resposta à radioterapia, e os resultados mostraram que os organoides de câncer retal eram sensíveis à radioterapia e ao paciente resposta clínica. Os resultados mostraram que a sensibilidade dos organoides do câncer retal à radioterapia foi altamente consistente com a resposta clínica dos pacientes (sensibilidade 78%, especificidade 92%, precisão 84%). Posteriormente, em tumores como câncer gástrico e câncer de mama, também foi encontrada concordância entre PDO e resposta dos pacientes com tumor aos medicamentos. Yan HHN et al construíram uma biblioteca organoide de câncer gástrico usando tecidos tumorais, tecidos paracancerosos e metástases linfonodais de 34 pacientes com câncer gástrico. Dois deles desenvolveram metástases tumorais e foram submetidos a uma combinação de cisplatina e 5-FU após a cirurgia, ambos com boa resposta. O outro caso recebeu quimioterapia antes da cirurgia e não respondeu à capecitabina após a cirurgia. O exame da sensibilidade dos compostos correspondentes do PDO nestes três casos mostrou que a sensibilidade do PDO ao medicamento estava em perfeita concordância com a resposta clínica de cada paciente. Guillen KP et al construíram PDX e PDO usando amostras de tumores resistentes à terapia endócrina, pacientes com câncer de mama recidivante e metastático, e essas amostras foram examinadas histomorfologicamente, genômica e sensibilidade aos medicamentos. Os resultados mostraram que tanto o câncer de mama PDX quanto o PDO foram altamente redutores das propriedades histobiológicas e genômicas de seus tumores de origem, e ambos responderam consistentemente aos medicamentos antitumorais. Uma paciente com câncer de mama triplo-negativo em estágio IIA neste estudo desenvolveu metástases hepáticas cerca de 1 ano após ser submetida a quimioterapia pré-operatória e tratamento cirúrgico. Os investigadores submeteram as construções PDO e PDX a testes de sensibilidade a medicamentos ex vivo e descobriram que o inibidor de microtúbulos eribulina teve o melhor efeito terapêutico. Com base neste resultado, os pacientes foram instruídos a se submeterem ao tratamento com eribulina, o que resultou na remissão completa das metástases hepáticas durante quase 5 meses após a administração. Esses estudos confirmam, até certo ponto, a possibilidade do PDO orientar a medicação de pacientes com tumores clínicos. Também foi demonstrado que, comparando a diferença na resposta a medicamentos entre órgãos normais e PDO, descobriu-se que medicamentos com alta seletividade ajudam a reduzir os efeitos colaterais tóxicos em pacientes clínicos. Assim, está claro que o teste de sensibilidade aos medicamentos pelo PDO para descobrir o regime medicamentoso mais apropriado ajudará a melhorar a eficácia clínica dos pacientes com tumor, reduzir os efeitos colaterais tóxicos, o risco de resistência aos medicamentos e as chances de recorrência do tumor, e maximizar os benefícios para pacientes.

   Portanto, contando com modelos organoides de câncer de bexiga derivados de pacientes, realizaremos experimentos de teste de sensibilidade a medicamentos de quimioterapia de perfusão de câncer de bexiga não invasivos musculares, estabeleceremos um sistema padronizado de teste de sensibilidade a medicamentos para organoides de câncer de bexiga e formularemos padrões de triagem para testes de sensibilidade a medicamentos de organoides de câncer de bexiga, de modo a rastrear o regime ideal de combinação de medicamentos, auxiliar no desenvolvimento clínico de novos protocolos de tratamento individualizados e realizar validação clínica multicêntrica para alcançar um verdadeiro "teste de medicamentos substitutos".

2. Questões e objetivos de pesquisa Questões de pesquisa: Este estudo compara a taxa de sobrevida de recorrência livre de tumor em um ano e a taxa de sobrevida de recorrência livre de tumor em três anos de pacientes no grupo de infusão de medicamentos sensíveis a organoides, o grupo de infusão de medicamentos não sensíveis a organoides, e o grupo de infusão de BCG por meio de um estudo de coorte, e a diferença na taxa de recorrência entre os três grupos é comparada por análise de sobrevida K-M unidirecional. Avaliação para avaliar o valor dos ensaios de sensibilidade a medicamentos em órgãos semelhantes a tumores na orientação da quimioterapia de perfusão individual para câncer de bexiga.

   Objetivo da pesquisa: avaliar o valor da aplicação de experimentos de sensibilidade a medicamentos em órgãos semelhantes a tumores na orientação da quimioterapia de perfusão individual para câncer de bexiga, observando a eficácia clínica do método de sensibilidade a medicamentos em órgãos semelhantes a tumores na orientação da quimioterapia de perfusão pós-operatória para pacientes com câncer de bexiga.

   Consulte Medidas de Resultados para obter detalhes

3. Metodologia de pesquisa 3.1 Desenho do estudo Este protocolo é baseado nas Diretrizes Técnicas para Ensaios Clínicos de Medicamentos Antineoplásicos e adota um estudo de coorte multicêntrico.

3.1.1 Agrupamento Veja Grupos e Intervenções para detalhes 3.1.2 Preparação organoide para câncer de bexiga

1. Coleta de amostras de câncer de bexiga O processo de coleta de amostras está de acordo com a ética hospitalar e com consentimento informado assinado. Os pacientes inscritos no experimento devem ser diagnosticados patologicamente com câncer de bexiga, e o tamanho das amostras de tumor retiradas cirurgicamente deve ser maior que 0,8 cm*3, tanto quanto possível, para verificação patológica, cultura organoide, teste de sensibilidade a medicamentos e assim por diante. Os tecidos tumorais devem ser coletados com atenção ao tempo de isquemia tecidual e criopreservação, e o tempo de coleta deve ser de 5 minutos quando os tecidos são retirados da circulação sanguínea humana, de modo a evitar necrose por estresse dos tecidos tumorais devido à hipóxia precoce.
2. Preparação de órgãos de câncer de bexiga No processo de processamento de tecidos, foram utilizadas trituração física e digestão com colagenase para processar as amostras de tecido, e os organoides processados ​​​​e digeridos precisaram ser filtrados através de peneiras celulares de diferentes diâmetros antes da cultura, de modo a fazer os organoides obtidos uniformes em tamanho e facilitam a unificação de padrões. Em seguida foram plantadas em matriz de gel tridimensional e cultivadas em meio especial.
3. Expansão e cultura de organoides de câncer de bexiga O estado de crescimento dos organoides foi observado microscopicamente, e imuno-histoquímica e imunofluorescência foram utilizadas para caracterizar os organoides, confirmar a presença de células tumorais e avaliar sua morfologia. Órgãos carcinóides do câncer de bexiga foram eliminados e congelados.

3.1.3 Teste de sensibilidade a medicamentos organoides de tumor de câncer de bexiga Depois de observar o número de organoides ao microscópio para atingir o número que pode ser submetido a testes de sensibilidade a medicamentos, o meio organoide foi aspirado e descartado. Adicione 3 mL de solução digestiva à placa de Petri, separe as gotículas, digerir a 37°C, sopre os organoides e observe ao microscópio, quando os organoides são digeridos em uma massa celular homogênea contendo 2-3 células, adicione 2 vezes o volume da solução digestiva para encerrar a digestão. 1500 rpm, centrifugue as células durante 3 minutos e depois aspire e descarte o sobrenadante.

Ressuspender as células com meio, tentar não produzir bolhas de ar e diluir o meio para gel na proporção de 1:1,5, depois inocular o gel misto a 10uL/poço com uma pipeta de canal único em placas pré-resfriadas de 384 poços com 3.000 organoides por poço (esta operação foi realizada em gelo). Após misturar o meio com a goma na proporção de 1:1 (40uL:40uL), o meio foi dispensado na placa de 384 poços a 10uL/poço como um grupo branco. Após bater suavemente na placa de 384 poços para que as gotículas de gel ficassem planas no fundo dos poços, a placa foi colocada em uma incubadora por 30 min para permitir que as gotículas de gel solidificassem e meio BCOs pré-aquecido foi adicionado a 40 uL. /bem. Aos poços de teste de drogas, bem como aos poços vazios ao redor dos poços de controle, foram adicionados 40 μL de solução de PBS e colocados em uma incubadora de dióxido de carbono para evitar que o líquido evaporasse e fizesse com que as gotas de gel secassem.

Após 3 dias de incubação e observação, foi realizada observação microscópica do estado da amostra em cada poço para troca de fluido de meio volume.

Projetar o protocolo de teste de sensibilidade ao medicamento de acordo com os requisitos da tabela a seguir, configurar o grupo controle, grupo branco e grupo de teste de medicamento, o medicamento foi dissolvido de acordo com as instruções e diluído 4 vezes em 6 concentrações com meio organoide, respectivamente; usando ensaio de viabilidade celular luminescente, o medicamento foi testado em diferentes concentrações da concentração semi-inibitória (IC50), inibição de células tumorais (IR), o grau de desvio do IC50 da concentração do medicamento no sangue, AUC (área sob a dose -curva de resposta), os critérios de avaliação dos resultados do ensaio de sensibilidade ao medicamento tomam IC50 e IR como índices principais, juntamente com o grau de desvio do IC50 da concentração do medicamento no sangue e os resultados da AUC como julgamento auxiliar (para detalhes, consulte 3.10.3), avaliar os efeitos na sobrevivência e proliferação da classe de organismos e dar orientação clínica do uso do medicamento.

Tabela 1 Métodos para agrupar testes de sensibilidade a medicamentos Método de agrupamento de testes de sensibilidade a medicamentos Grupo em branco: Sem organoide, sem adição de medicamento, 6 poços replicados por placa. Grupo controle: Inoculado com organoides, sem adição de exposição a medicamentos. Grupo de teste de drogas: Inoculado com organoide, adicione exposição ao medicamento. 3.1.4 Regimes de combinação de medicamentos quimioterápicos Tabela 2 Medicamentos quimioterápicos de perfusão Gemcitabina □ Pirorrubicina □ Epirrubicina □ Silvestrol □ Adriamicina (doxorrubicina) □ 3.2 Local do estudo e população do estudo (fonte e critérios de exclusão de inclusão) Veja o desenho do estudo para detalhes 3.3 Variáveis ​​​​do estudo (fatores) e medidas O positivo o grupo de controle não foi submetido à cultura organoide, bem como ao teste de sensibilidade a medicamentos organoides.

Os demais pacientes foram submetidos a testes organoides de sensibilidade a medicamentos de acordo com o protocolo de teste de sensibilidade a medicamentos, utilizando ensaio de viabilidade celular luminescente para testar a concentração semi-inibitória (IC50) do medicamento, a taxa de inibição (IR) das células tumorais, o grau de desvio do IC50 da concentração sanguínea do medicamento e da AUC (área sob a curva dose-resposta) em diferentes concentrações, e os critérios de avaliação dos resultados dos testes de sensibilidade ao medicamento foram baseados no IC50,IR como os principais índices com o desvio IC50 da concentração do medicamento no sangue, os resultados da AUC são um julgamento auxiliar (ver 3.10.3 para detalhes), para avaliar o seu efeito na sobrevivência e proliferação de órgãos de classe.

Os pacientes submetidos à cultura organoide e ao teste de sensibilidade aos medicamentos foram submetidos à instilação de agentes quimioterápicos na bexiga, de acordo com a experiência dos médicos. Os cinco medicamentos perfundidos incluíram gencitabina, piroxicam, epirrubicina, mitomicina e adriamicina (doxorrubicina). De acordo com a sensibilidade de seus medicamentos de perfusão no teste de sensibilidade a medicamentos organoides, eles foram divididos em grupo de perfusão de medicamentos sensíveis a organoides e grupo de perfusão de medicamentos não sensíveis a organoides. Regime de perfusão: incluindo quimioterapia de perfusão de indução (4-8 semanas após a cirurgia, 1 vez por semana, 4 vezes no total) e quimioterapia de perfusão de manutenção (1 vez por mês, 11 vezes no total).

Regime de infusão de BCG: 6 infusões de indução seguidas de 3 infusões de reforço uma vez a cada 2 semanas para manter uma boa resposta imunológica, seguidas de 10 infusões de manutenção uma vez por mês, totalizando 19 infusões ao longo de 1 ano.

Medições clínicas: os dois grupos de pacientes no grupo de perfusão de medicamentos sensíveis a organoides e no grupo de perfusão de medicamentos não sensíveis a organoides foram acompanhados e analisados ​​quanto aos desfechos primários e secundários do estudo, e a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier unidirecional foi realizada para comparar as diferenças nas taxas de recorrência entre os dois grupos. O modelo de proporção de risco COX foi utilizado para analisar a razão de risco de recorrência do sexo, idade, estágio e grau do tumor dos pacientes entre os dois grupos.

3.4 Resultados do estudo Os critérios RECIST1.1 foram utilizados para avaliação da eficácia, e os critérios Choi e os critérios mRECIST foram utilizados como critérios auxiliares de avaliação da eficácia.

Endpoints primários do estudo: taxa de sobrevida livre de recorrência de tumor em um ano, taxa de sobrevida livre de recorrência de tumor em três anos.

Endpoints secundários: taxa de sobrevida livre de progressão tumoral em um ano, taxa de sobrevida livre de progressão tumoral em três anos.

3.5 Acompanhamento Os dois grupos de pacientes no grupo de perfusão de medicamentos sensíveis semelhantes a órgãos e no grupo de perfusão de medicamentos não sensíveis semelhantes a órgãos foram acompanhados e analisados ​​quanto aos desfechos primários e secundários do estudo.

A cistoscopia é o método de escolha na avaliação de pacientes com NMIBC e não há alternativa não invasiva à cistoscopia. Portanto, o acompanhamento do NMIBC deve ser baseado em cistoscopia regular. Se durante o exame forem encontradas lesões suspeitas da mucosa da bexiga, deve-se realizar biópsia para esclarecer os achados patológicos. Citologia esfoliativa de urina, TC/CTU ou RM/MRU são realizadas se necessário, mas nenhuma delas pode substituir completamente a cistoscopia.

O plano de revisão da cistoscopia: o NMIBC de baixo risco é realizado uma vez aos 3 meses e 12 meses após a cirurgia no 1º ano, e uma vez por ano a partir de então até o 3º ano; O NMIBC de risco intermediário é realizado uma vez aos 3 meses, 6 meses e 12 meses após a cirurgia, a cada 6 meses no 2º ano e a cada ano a partir de então até o 3º ano; O NMIBC de alto risco é realizado a cada 3 meses nos primeiros 2 anos e a cada 6 meses a partir de então até o 3º ano.

3.6 Tamanho da amostra Um tamanho de amostra de 293 casos foi suficiente para cumprir os requisitos dos desfechos do estudo.

Houve 73 casos no grupo de perfusão de medicamentos não sensíveis a organoides e 110 casos cada no grupo de perfusão de medicamentos sensíveis a organoides e no grupo de controle positivo.

Base de cálculo:

1. Cálculo do tamanho da amostra para o desfecho do estudo da taxa de sobrevida livre de tumor em um ano: espera-se que a taxa de sobrevida livre de tumor em um ano seja de 73% no grupo de infusão de medicamentos sensíveis a organoides e 50% no grupo não sensível a organoides grupo de infusão de drogas, com α = 0,05 unilateral, β = 0,2, e a proporção dos tamanhos amostrais dos dois grupos é 1 (grupo experimental: grupo controle), os tamanhos amostrais dos dois grupos são 55 casos no grupo experimental, 55 casos no grupo controle e 110 casos no grupo controle positivo. 55 casos no grupo controle, totalizando 110 casos, e considerando 20% de eliminação, é necessário um tamanho total de amostra de 138 casos.
2. Calcule o tamanho da amostra de acordo com o desfecho do estudo de taxa de sobrevida livre de tumor em três anos: espera-se que a taxa de sobrevida livre de tumor em três anos do grupo de infusão de medicamentos sensíveis a organoides seja de 63%, e os três anos a taxa de sobrevida livre de tumor por ano do grupo de infusão de drogas insensíveis a organóides será de 40%, e o α = 0,05, β = 0,2 unilateral, e a proporção dos tamanhos das amostras dos dois grupos será 1 (grupo experimental: grupo de controle ), de modo que os tamanhos amostrais dos dois grupos serão calculados como 58 casos no grupo experimental, 58 casos no grupo controle e 11 casos no grupo controle, levando em consideração a eliminação de 20% e um tamanho total da amostra de Serão necessários 138 casos. 58 casos no grupo controle, totalizando 116 casos, e considerando 20% de eliminação, foi necessário um tamanho amostral total de 146 casos.
3. De acordo com os resultados da literatura, a taxa de sobrevida livre de tumor em um ano do grupo de controle positivo é de 75% e, de acordo com o pré-teste, a taxa de sobrevida livre de tumor em um ano da infusão de medicamentos sensíveis a organóides espera-se que o grupo seja de 73%, e o valor de corte de não inferioridade é 0,2 (grupo de controle-grupo experimental), e a proporção dos tamanhos amostrais dos dois grupos é uma, com o alfa unilateral sendo 0,05 e o beta sendo 0,2 , o tamanho da amostra dos dois grupos é calculado como 74 casos do grupo de infusão de medicamentos sensíveis a organoides, 74 casos do grupo de controle positivo e um total de 116 casos do grupo experimental. 74 casos e 74 casos no grupo de controle positivo, totalizando 148 casos. Considerando uma eliminação de 20%, o tamanho total da amostra necessária é de 186 casos.
4. De acordo com os resultados da literatura, a taxa de sobrevida livre de tumor em três anos do grupo de controle positivo é de 65% e, de acordo com o pré-teste, a taxa de sobrevida livre de tumor em três anos da infusão de medicamentos sensíveis a organóides espera-se que o grupo seja de 63%, e o valor de corte de não inferioridade é 0,2 (grupo de controle-grupo de teste), e a proporção dos tamanhos amostrais dos dois grupos é 1 se o alfa unilateral for 0,05 e o beta for 0,2, o tamanho da amostra dos dois grupos é calculado como 88 casos do grupo de infusão de medicamentos sensíveis a organoides e 88 casos do grupo de controle positivo. 88 casos e 88 casos no grupo de controle positivo, totalizando 176 casos, e levando em consideração a eliminação de 20%, foi necessário um tamanho total de amostra de 220 casos.

3.7 Fluxograma das técnicas de pesquisa Esta seção (fotos) descreve o percurso técnico do projeto. 3.8 Coleta e gerenciamento de dados Os dados foram coletados por observação e registro, e os dados originais foram verificados item por item para garantir que os dados eram consistentes com aqueles nos registros originais. Ao final do experimento, ele foi entregue ao estatístico para análise estatística.

3.9 Métodos de análise estatística Os dados medidos são geralmente estatísticas descritivas com média, desvio padrão, mediana, valores mínimos e máximos. Para variáveis ​​categóricas será realizada estatística descritiva conforme frequência e percentual.

O software estatístico SPSS foi aplicado para análise estatística. Os dados de medição foram expressos como média ± desvio padrão (x ± s), teste t, ANOVA unidirecional (teste post hoc comparações dois por dois usando o método LSD), teste qui-quadrado foi utilizado para comparação de taxas, e o método de Spearman foi utilizado para análises de correlação. p < 0,05 foi considerado que a diferença foi estatisticamente significativa.

3.10 Controle de qualidade 3.10.1 Coloração HE de órgão de classe e resultados de imuno-histoquímica Em conformidade com os resultados dos testes patológicos, indicando que as amostras organoides e tumorais construídas podem reter melhor a estabilidade patológica.

3.10.2 Análise organoide WES ou RNA-Seq Amostras organoides e tumorais construídas podem reter melhor a estabilidade genética. 3.10.3 Critérios de avaliação para resultados de testes de sensibilidade a medicamentos O padrão de avaliação dos resultados de testes de sensibilidade a medicamentos tem IC50, IR como índice principal, com o grau de desvio entre IC50 e concentração de medicamentos no sangue, resultados de AUC como julgamento auxiliar, quando os índices de sensibilidade IC50, IR são atendidos ao mesmo tempo, é considerado sensível; quando não é possível atender os índices IC50, IR ao mesmo tempo, IC50 combinado com o IC50 e necessidade da concentração da razão do menor grau de diferença nos resultados da sensibilidade.

3.10.3.1 Critérios de avaliação do IC50. IC50>20× Não sensível

1×<IC50≤20× Baixa sensibilidade 0,5×<IC50≤1× IC50≤0,5× moderadamente sensível altamente sensível O grupo sensível inclui fortemente sensível e moderadamente sensível, e o grupo insensível inclui fracamente sensível e resistente.

3.10.3.2 Critérios de avaliação para taxa de inibição tumoral IR. RI <30% é insensível e classificado como negativo; IR≥30% é sensível e classificado como positivo, em que 30%≤IR<50% é baixa sensibilidade, 50%≤IR<70% é sensibilidade moderada e IR≥70% é alta sensibilidade.

Taxa de sensibilidade = número de casos com RI ≥ 30% / número total de casos do grupo.

3.10.3.3 Cálculo do grau de desvio do IC50 da concentração sanguínea: o grau de desvio da concentração sanguínea refere-se ao grau de diferença entre o valor IC50 obtido no teste de sensibilidade ao medicamento e a concentração sanguínea, e é calculado como IC50/concentração sanguínea.

Quanto menor a proporção, mais eficaz é o medicamento. 3.10.3.4 Critérios para avaliação dos resultados da AUC (área sob a curva medicamento-tempo): O cálculo específico da AUC geralmente envolve a integração da curva concentração-tempo.

A AUC está intimamente relacionada com a relação dose-resposta. Na curva dose-resposta da eficácia do medicamento, a AUC é um indicador composto do efeito global de um medicamento num organismo entre a dose e a resposta. Uma AUC maior está geralmente associada a um melhor efeito terapêutico.

3.11 Tratamento pós-estudo de organoides Os organoides construídos com sucesso neste estudo serão destruídos e descartados uniformemente após o estudo de acordo com as normas de descarte de resíduos biomédicos.