Optimerad remission i alkoholrelaterad levercirrhos (Pro-ALC)

I Danmark ökas förekomsten av levercirrhos femfaldigt för män och tredubblas för kvinnor under de senaste fyrtio åren. 2008 diagnostiserades cirka 15 000 människor med levercirrhos. Patienter som återinlämnas till sjukhuset har en högre 90-dagars dödlighet än de som undviker återtagande.

Den kliniska förloppet med levercirrhos inkluderar komplikationer av ascites, lever -encefalopati, variceal blödning, njurdysfunktion och infektioner med upprepade inlägg på sjukhus som markant förvärrar prognosen. Dessa komplikationer drivs av utvecklingen av portalhypertoni i levern. Denna utveckling till det "dekompenserade" stadiet anses vara ett kännetecken i sjukdomsbanan, eftersom dekompensationen är förknippad med en markant ökad risk för ytterligare komplikationer och dödsfall.

Flera kliniska studier har försökt hitta medicinska läkemedel som förhindrar komplikationer relaterade till portalhypertoni eller bromsa ytterligare progression i cirrhos. Ändå indikerar ökande bevis att aktiva mått på behandling av den underliggande orsaken till leversjukdom och avlägsnande av de toxiska medlen som orsakar cirrhos kan bromsa sjukdomens progression eller till och med inducera regression av cirrhos. Detta koncept beskrivs som leverkompensation.

Kliniska och biokemiska egenskaper som BMI och albuminnivåer kan vara kopplade till ersättning, men det finns ett markant behov av kliniska studier som undersöker nya biomarkörer med förmågan att förutsäga och övervaka förbättring av levercirrhos, med och utan påverkan av alkohol.

Mellan 75% och 80% av patienterna med levercirrhos i Danmark har eller har haft en skadlig användning av alkohol. Beroende av alkohol leder till social isolering, risken för arbetslöshet och en minskad efterlevnad av hälsovården (8). Cirrhos är relaterad till minskad livskvalitet och påverkar patienter och släktingar både emotionella och socioekonomiskt.

Alkoholrelaterad leversjukdom (ARLD) har en stor inverkan på patientens hälsa och liv, och behandlingen handlar om symtomatisk lättnad och förebyggande av ytterligare komplikationer. Det finns ett ouppfylldt behov av att undersöka behandlingsalternativ som inte bara lindrar komplikationer, utan också tar upp de underliggande vägarna för alkoholrelaterad leversjukdom, också i svåra stadier av alkoholrelaterad cirrhos (ALC). Tidigare studier som undersöker ersättning i ARLD är retrospektiva och inte utformade för det exakta syftet.

Faktorer som BMI, kvinnligt kön och mindre portalhypertoni är kända för att vara förknippade med en ökad sannolikhet för ersättning. Ytterligare faktorer för genetisk aktivering och molekylära biomarkörer från proteomen och lipidom har bara väckt mindre uppmärksamhet, och effekterna av att behandla förarna för dekompensation, portalhypertoni och alkoholanvändning och deras inverkan på den naturliga orsaken till sjukdom har inte behandlats.

Gastro-enheten, Amager-Hvidovre Hospital (AHH) har ett rekordområde på 550 000 medborgare söder och väster om Köpenhamn. Gastro -enheten är den största i Danmark, med appen. 90 antagningar dagligen. 140 personer diagnostiseras med levercirrhos varje år i vår avdelning, antingen genom remiss från allmän praxis eller genom debut av sjukdomar under sjukhusinläggningen. Från november 2019 till mars 2022 utvärderades 357 patienter med avseende på levercirrhos i gastroenheten. 20 % av dessa dog inom tolv månader. 75% hade alkoholanvändning som den främsta orsaken till levercirrhos.

Nya molekylära tekniker och riskförutsägelse Molekylär patofysiologi för ARLD förstås ofullständigt. Karakterisering av proteomdynamiken över spektrumet av ALD kan ge ny insikt i sjukdomsmekanismer för både progression och remission av sjukdom. De senaste framstegen inom MS-baserade proteomik har kraftigt utvidgat sin inverkan på biomedicinsk och klinisk forskning. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av tusentals proteiner, vilket gör det lämpligt för att studera sjukdomsmekanismer och identifiering av biomarkörer. Tidigare studier har bedömt proteomen i metabolisk dysfunktionassocierad steatotisk leversjukdom (MASH) och alkoholrelaterad fibros, och proteomiska profiler visade en stark associering till svårighetsgraden av leversjukdom. Studier med påföljande uppföljning i de allvarliga stadierna av ALC saknas fortfarande.

MS-baserade proteomik kan identifiera biomarkörer med prediktivt värde i kliniken, särskilt i utsikterna för sjukdomens remission. Koppling till kliniska data och resultat kan stödja användningen av proteomiska biomarkörer vid förutsägelse och övervakning av remission i AH och ersättning i ALC.

Flera markörer för inflammation och cytokiner är involverade i att driva dekompensation och har potential att förutsäga risken för tidig död. Det är okänt om sådana markörer kan förutsäga remission och ersättning i ALC och AH. Tidigare studier har bedömt förhållandena mellan inflammation och dödlighet, men prospektiva studier som undersöker sambanden mellan biomarkörer för metabolism och prognos, övervakning och effektivitet OG -behandling i ALC saknas.

Transkriptomik och genaktivering vid progression och remission av leversjukdom Molekylär och cellulär komplexitet hos levermikro -miljön förblir ett viktigt hinder som hindrar utvecklingen av potentiella behandlingar. Tidigare studier i RNA-sekvensering är små och utan uppföljning.

Med framsteg inom genchips och sekvensering med hög genomströmning har flera prognostiska gensignaturer fastställts för att förutsäga total överlevnad vid levercirrhos.

Nya RNA -sekvensering av enstaka cell och bulk -RNA -sekvenseringsstudier har visat att specifika mesenkymala, endotel- och monocytlinjer berikas i cirrotiska lever.

Helvävnad (bulk) RNA -sekvensering ger en genomsnittlig avläsning av RNA -innehållet i ett prov, som representerar blandade RNA -signaler från de olika cellerna som finns i vävnaden och påverkas således signifikant av celltypens prevalens. Jämfört med RNA-sekvensering av enkelcells (SCNA-seq) kan inte bulk-RNA-sekvensering användas för att studera sällsynta cellpopulationer, eller specifika patogena cellunderpopulationer, men det ger insikt i mönster av patogen gentranskription och cellulär dysfunktion, särskilt när de är kopplade till klinisk fenotyp och jämförs med ett scNA-SEQ-bibliotek.

Inga studier har tidigare jämfört förändringar i transkriptomet efter avlägsnande av de toxiska medlen som orsakat leverskador.

I ALC finns det ett otillfredsställt behov av att undersöka behandlingsalternativ som behandlar de underliggande vägarna för ARLD, även i svåra skeden av cirrhos. Induktion av ersättning kommer att förlänga både överlevnad och "antagningsfritt" vardagsliv för patienter med ALC.

Mål Det övergripande målet med den aktuella studien är att undersöka molekylprofilen och vägarna hos personer med ALD för att stödja personlig övervakning och uppföljning i levercirrhos.

Hypotesen Prognosen för ALC varierar beroende på kontinuerligt eller upphör med alkoholintag. Alkohol kan påverka överlevnad och ersättning i ALC. Alkohol kan påverka molekylprofilen för varje person med ALC och därmed påverka sjukhusinläggningar, återtaganden och progression av levercirrhos.

Bättre kunskap om molekylprofilen för personer med ALC kommer, i kombination med kliniska egenskaper hos patientens hälsa och fysiska prestanda, gör det möjligt för oss att planera och administrera åtgärder för personlig behandling, övervakning och uppföljning av personer med ALC.

En djupare inblick i de molekylära mekanismerna för leverdrivande progression och remission av cirrhos kommer att kombinera med klinisk data-stöder vår förmåga att förutsäga resultat vid cirrhos, underlätta personlig övervakning och uppföljning och stödja rätt och snabb behandling för rätt patient. Resultaten kan också stödja utvecklingen av nya molekylära läkemedelsmål för behandling och förebyggande av cirrhos i framtiden.

Metoder Studien är en incidenskohort där patienter kommer att följas från diagnos till döds eller tillbakadragande från kohorten. Vi kommer att försöka inkludera patienter i följd inom tre månader efter diagnosen. Resultaten kommer att rapporteras efter strobe -riktlinjer.

Studiepersoner alla personer med en första hänvisning till utredning för och diagnos av alkoholrelaterad levercirrhos i gastroenheten, och alla patienter med en debut av alkoholrelaterad levercirrhos under inträde oavsett orsaken till inträde, är berättigade till inkludering.

Denna studie äventyrar inte diagnostik eller behandling av cirrhos eller komorbiditeter, och inkludering i interventionsstudier under den framtida uppföljningen är möjlig.

Rekrytering Alla patienter med en debut av levercirrhos som misstänks vara relaterad till användning av alkohol, och oavsett tid och omständigheter för diagnos, kommer komorbiditeter och svårighetsgrad av sjukdom att erbjudas inkludering i kohorten. Alla deltagare kommer att vara engagerade av antingen läkaren eller sjuksköterskan som tillhandahåller vårdstandard. Alla deltagare kommer att informeras skriftligen såväl som muntligt av studierutredare och projektsköterskor.

Intervention av alkoholavvänjning och vårdstandard Alla patienter med ALC behandlade i gastroenheten, AHH, och därför kommer alla deltagare i denna studie att erbjudas standarden för vårdbehandling. Detta inkluderar undersökningar med standardbiokemi, ultraljud, fibroskan, CT-skanning och endoskopi, samt näringstillskott, medicinsk behandling för cirrhos och komplikationer och komorbiditeter.

Interventionen av alkoholavvänjning kommer att erbjudas som standard för vårdbehandling till alla patienter med ALC. Interventionen inkluderar medicinsk behandling av abstinenssymtom och begär och stöd för att hänvisa till kommunala erbjudanden om alkoholbehandling. Dessutom, i syfte att underlätta alkoholavvänjning och stödja ytterligare alkoholbehandling i den primära sektorn, kommer patienterna att erbjudas motiverande intervjuer (MI) som en del av deras behandling.

Patienterna och möjliga vårdgivare kommer att bjudas in till tre MI -sessioner som utförs av specialiserade sjuksköterskor i leverkliniken under de första tre månaderna efter diagnosen.

Data från patienttidskrifter I denna studie kommer vi att hämta information från Patient Journal efter att skriftligt samtycke har tillhandahållits.

Uppgifter som hämtats från patienttidskrifter före erhållning är begränsad till diagnosen ALC, tid för diagnosen och orsaken till sjukhusinläggning eller remiss som ledde till diagnos av ARLD. Biometriska uppgifter som erhållits före skriftligt samtycke till deltagande kommer inte att hämtas för studien. Dessa uppgifter kan samlas in från en period av noll till trettio dagar före inkludering och kommer att vidarebefordras till klinikerutredare och studera personal.

Data och personlig information registreras och övervakas efter aktuell lagstiftning, lagen om dataskydd och som anges i den allmänna dataskyddsförordningen.

Genetiska analyser DNA kommer att extraheras från blodceller, helblod och från avföring från deltagarna. DNA kommer att lagras vid -80C, tills vidare analys. Genotypning kommer att utföras med ett GWAS-chip (dvs. Riktad genomisk mappning) med användning av Illumina exomechip berikad för proteinförändring, storeffekt varianter. Ultra-sällsynta varianter (<1/1000) kommer inte att fångas. Resultaten från genetiska analyser i kombination med kliniska data kan identifiera gener som är förknippade med dödlighet, överlevnad och svårighetsgrad av sjukdom i ett "riskprofilering" -sammanhang. Genomisk analys innefattar vanliga varianter och polygenisk riskprofilering på vanliga varianter. Hela genomsekvensering kommer inte att utföras.

Genetiska analyser på bakteriellt DNA från avföring kommer att användas för jämförande analyser av samspelet mellan tarmdysfunktion och levercirrhos.

Transkriptomik, metabolomik och proteomik för identifiering av nya potentiella markörer som är involverade i utveckling, progression och remission av ALC, transkriptomik, metabolomik och proteomik kommer att utföras på levervävnad och blod. Analyser kommer att utvärdera expressionsnivåer och cellulär lokalisering av möjliga biomarkörer inklusive receptor och ligander samt nedströms signalmolekyler. De tillämpade teknikerna beskrivs nedan. Tillsammans med kliniska data kommer resultaten att förbättra förståelsen för möjliga drivkrafter för remission och utveckling av ARLD.

Fältet för upptäckt omics tenchnologier utvecklas snabbt, och metoder kan vara föremål för anpassningar för att säkra kvalitet, relevans och de bästa priserna för analysen.

Proteomikanalysanalys av plasmaprover säkerställer en hög framgångsgrad och upprepad provtagning över tid tolereras lätt av patienterna. Snap-frasen leverbiopsier kommer att samlas in vid baslinjen och vid 12 månader för analys. Beredning av prover och vätskekromatografi och masspektrometri (LC/MS) -analys kommer att följa tekniker som tidigare beskrivits från Torben Hansen och Center for Basic Metabolic Research (CBMR), Köpenhamns universitet. I enstaka plasma-proteomanalys elueras peptidblandningen Evosep One LC System (Evosep Biosystems) kopplat online till en Orbitrap Exploris 480 masspektrometer.

Lipidomics -analyser:

Analys utförs enligt toppmoderna befintliga procedurer och modifieras för att tillämpa den bästa tillgängliga tekniken.

After plasma preparation, chromatographic separation is performed on Waters Acquity BEH C18 column (1.7μm X 2.1mm X 100 mm) using the gradient of two standard mobile phases (mobile phase A contains water, 0.1% formic acid and 10 ml 1M ammonium acetate, mobile phase B composes isopropanol and acetonitrile (1:1) with the same addition of formic acid and ammonium acetate).

Masspektrometri-identifieringen av föreningar riktas baserat på ett förberedt bibliotek med målmetaboliter i plasma.

Baserat på resultaten från Lipidomics -analyserna kommer vi att välja en panel med diagnostiska markörer, som mest effektivt kommer att beskriva hastigheten på sjukdomens progression. För de valda biomarkörerna kommer vi att utveckla en absolut kvantitativ metod, baserad på LC-MS-MS (Triple Quadrupole MS i MRM-läge) -metodik, med användning av kommersiellt tillgängliga standardföreningar, inklusive stabila isotopmärkt föreningar som interna standarder. Metoden kommer att valideras enligt standardiserade protokoll. När det gäller framgångsrika resultat kommer vi att kunna ställa in koncentrationsgränser för panelens biomarkörer för förutsägelse av långsam, medelstor och snabb sjukdomsprogression, liksom på lång sikt gör metoden redo att överföra till kliniska laboratorier och personlig medicin.

Den biologiska analysen och datahanteringen av proteomik och lipidomik kommer att äga rum vid CBMR.

Transkriptomomikanalyser analyser och biostatistik kommer att utföras vid centrum för grundläggande metabolisk forskning.

Bulk-RNA-sekvensering ger ett vävnadsomfattande transkriptionslandskap och möjliggör djup undersökning av transkriptomet, men det skiljer inte mellan enskilda celler. För att identifiera gener som spelar en viktig roll i progressionen eller ersättningen av AH kommer vi att jämföra datasätt från bulk -RNA -sekvensering i AH till redan etablerade datasätt från enstaka cell -RNS -sekvensering av levern.

Baserat på gener som samtidigt föreslås av bulk-RNA i våra prover och scraseq, kan vi utforska de viktigaste transkriptionella regulatorerna i ALC.

Vi kommer att använda denna resurs för att beräkna dekonvolute Bulk -transkriptomdata för leverbiopsierna för att uppskatta den relativa överflödet av varje celltyp av levern (hepatocyt, leverstellatceller, lever sinusformade epitelceller, etc.) hos varje patient. Möjliga sjukdomsreglerare för både progression och ersättning kommer att bedömas.

Forskning Biobank En biobank kommer att upprättas för studien. Biobanken kommer att innehålla blod som samlas in vid baslinjen, tre månader, 1 och 3 år, och levervävnad och avföring som samlas in vid baslinjen och efter 1 år. Vid varje tidpunkt samlas 15 ml blod och 3 gram avföring. Vid baslinjen och efter 1 år samlas 0,2 gram levervävnad. Om en deltagare har ascites och behöver paracentes, kommer en subkutan fettbiopsi att tas från snittplatsen på buken.

Överskottsmaterial från studien kommer att överföras till en biobank för framtida forskning.

Perspektiv Studien kommer att bidra till en bättre karaktärisering av avancerad leversjukdom relaterad till alkohol och bidra till en förbättrad framtida organisation av behandlings- och rehabiliteringserbjudanden till patienter med leversjukdom. Grundlig karaktärisering och på varandra följande inkludering kommer att förbättra vår förståelse för förekomsten, prevalensen och påverkan av ALC i befolkningen, liksom användningen av hälsovårdsresurser som tilldelats dess behandling.

En djupare inblick i de molekylära mekanismerna för leverprogression och remission kommer, i kombination med kliniska data, att stödja vår förmåga att förutsäga resultat i cirrhos, underlätta personlig övervakning som syftar till att tillhandahålla rätt behandling för rätt patient vid rätt tidpunkt.

Den prospektiva kohortstudien kommer att ytterligare bidra till identifiering av tidigare oidentifierade riskfaktorer som är betydande för överlevnad och användning av hälsovårdstjänster; och därmed utgöra grunden för att genomföra förändringar i hälsopraxis som erbjuder både ekonomiska och medicinska fördelar. Dessutom kan studien avslöja nya områden för interventionell forskning med kliniskt relevanta slutpunkter.