Remisión optimizada en cirrosis hepática relacionada con el alcohol (Pro-ALC)

En Dinamarca, la incidencia de la cirrosis hepática se incrementa cinco veces para los hombres y se triplica para las mujeres en los últimos cuarenta años. En 2008, aproximadamente 15,000 personas fueron diagnosticadas con cirrosis hepática. Los pacientes que son readmitidos en el hospital tienen una mayor mortalidad de 90 días que aquellos que evitan el readmisión.

El curso clínico de la cirrosis hepática incluye complicaciones de la ascitis, encefalopatía hepática, sangrado varicoso, disfunción renal e infecciones con admisiones repetidas al hospital que empeoran notablemente el pronóstico. Estas complicaciones son impulsadas por el desarrollo de la hipertensión portal en el hígado. Esta progresión a la etapa 'descompensada' se considera un sello distintivo en el curso de la enfermedad, ya que la descompensación se asocia con un riesgo notablemente mayor de complicaciones y muerte adicionales.

Varios estudios clínicos han tratado de encontrar remedios médicos que prevenieran complicaciones relacionadas con la hipertensión portal o ralentizan una mayor progresión en la cirrosis. Sin embargo, la evidencia creciente indica que las medidas activas del tratamiento de la causa subyacente de la enfermedad hepática y la eliminación de los agentes tóxicos que causan cirrosis pueden retrasar la progresión de la enfermedad o incluso inducir la regresión de la cirrosis. Este concepto se describe como recompensación hepática.

Las características clínicas y bioquímicas, como los niveles de IMC y albúmina, pueden estar vinculadas a la recompensación, pero existe una marcada necesidad de estudios clínicos que investiguen biomarcadores nuevos con la capacidad de predecir y monitorear la mejora en la cirrosis hepática, con y sin el impacto del alcohol.

Entre el 75% y el 80% de los pacientes con cirrosis hepática en Dinamarca han tenido o han tenido un uso dañino de alcohol. La dependencia del alcohol conduce al aislamiento social, el riesgo de desempleo y una disminución del cumplimiento de la atención médica (8). La cirrosis está relacionada con la disminución de la calidad de vida y afecta a los pacientes y familiares tanto emocionales como socioeconómicamente.

La enfermedad hepática relacionada con el alcohol (ARLD) tiene un gran impacto en la salud y las vidas de los pacientes, y el tratamiento gira en torno al alivio sintomático y la prevención de complicaciones adicionales. Existe una necesidad insatisfecha de investigar las opciones de tratamiento que no solo alivian las complicaciones, sino que también abordan las vías subyacentes de la enfermedad hepática relacionada con el alcohol, también en etapas severas de la cirrosis relacionada con el alcohol (ALC). Estudios previos que exploran la recompensación en ARLD son retrospectivas y no están diseñados para el propósito exacto.

Se sabe que factores como el IMC, el género femenino y la hipertensión portal menor están asociados con una mayor probabilidad de recompensación. Los factores adicionales de activación genética y biomarcadores moleculares del proteoma y el lipidoma solo han atraído una atención menor, y no se ha abordado el impacto del tratamiento de los impulsores de la descompensación, la hipertensión portal y el consumo de alcohol, y su impacto en la causa natural de la enfermedad.

La unidad gastro, el Hospital Amager-Hvidovre (AHH) tiene un área récord de 550,000 ciudadanos al sur y al oeste de Copenhague. La unidad gastro es la más grande de Dinamarca, con la aplicación. 90 admisiones diariamente. 140 personas se diagnostica con cirrosis hepática anualmente en nuestro departamento, ya sea por derivación de la práctica general o por debut de la enfermedad durante el ingreso hospitalario. Desde noviembre de 2019 hasta marzo de 2022, 357 pacientes fueron evaluados para la cirrosis hepática en la unidad gastro. El 20 % de estos murieron en doce meses. El 75% tenía el consumo de alcohol como la causa principal de la cirrosis hepática.

Las nuevas tecnologías moleculares y la predicción del riesgo La fisiopatología molecular de ARLD se entiende incompletamente. La caracterización de la dinámica del proteoma en el espectro de ALD podría proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de la progresión y la remisión de la enfermedad. Los avances recientes en la proteómica basada en MS han extendido en gran medida su impacto en la investigación biomédica y clínica. Permite la identificación y cuantificación de miles de proteínas, lo que lo hace adecuado para estudiar mecanismos de enfermedades e identificación de biomarcadores. Estudios anteriores han evaluado el proteoma en la enfermedad hepática esteatótica (puré) asociada a la disfunción metabólica y la fibrosis relacionada con el alcohol, y los perfiles proteómicos mostraron una fuerte asociación con la gravedad de la enfermedad hepática. Todavía faltan estudios con seguimiento consecutivo en las etapas severas de ALC.

La proteómica basada en MS puede identificar biomarcadores de valor predictivo en la clínica, especialmente en la perspectiva de la remisión de la enfermedad. La vinculación con datos y resultados clínicos puede respaldar el uso de biomarcadores proteómicos en la predicción y monitoreo de la remisión en AH y la recompensación en ALC.

Varios marcadores de inflamación y citocinas están involucrados en impulsar la descompensación y tienen el potencial de predecir el riesgo de muerte temprana. Se desconoce si tales marcadores pueden predecir la remisión y la recompensación en ALC y AH. Estudios previos han evaluado las relaciones entre la inflamación y la mortalidad, pero los estudios prospectivos que investigan las asociaciones entre los biomarcadores del metabolismo y el pronóstico, el monitoreo y la eficacia del tratamiento con OG en ALC están faltando.

Transcriptómica y activación génica en la progresión y remisión de la enfermedad hepática La complejidad molecular y celular del microambiente hepático sigue siendo un obstáculo clave que obstaculiza el desarrollo de tratamientos potenciales. Estudios previos en la secuenciación de ARN son pequeños y sin seguimiento.

Con avances en chips genéticos y secuenciación de alto rendimiento, se han establecido varias firmas de genes pronósticos para predecir la supervivencia general en la cirrosis hepática.

Los recientes estudios de secuenciación de ARN de una sola célula y secuenciación de ARN a granel han demostrado que los linajes mesenquimales, endoteliales y de monocitos específicos se enriquecen en hígados cirróticos.

La secuenciación de ARN de tejido completo (a granel) proporciona una lectura promedio del contenido de ARN de una muestra, que representa señales de ARN mixtas de las diferentes células presentes dentro del tejido y, por lo tanto, está significativamente influenciada por la prevalencia del tipo de célula. En comparación con la secuenciación de ARN de una sola célula (SCRNA-SEQ), la secuenciación de ARN a granel no puede usarse para estudiar poblaciones de células raras, o subpoblaciones de células patogénicas específicas, pero proporciona información sobre los patrones de la transcripción génica patogénica y la disfunción celular, especialmente cuando se une al fenotipo clínico y cuando se compara con una biblioteca de SCRNA-SEQ de tejido livino.

Ningún estudio ha comparado previamente los cambios en el transcriptoma después de la eliminación de los agentes tóxicos que causan daño hepático.

En ALC, existe una necesidad insatisfecha de investigar las opciones de tratamiento que aborden las vías subyacentes de ARLD, también en etapas severas de cirrosis. La inducción de la recompensación prolongará tanto la vida diaria de supervivencia como 'libre de ingresos' de pacientes con ALC.

Objetivos El objetivo general del presente estudio es investigar el perfil molecular y las vías en personas con ALD para apoyar el monitoreo personalizado y el seguimiento en la cirrosis hepática.

Hipótesis El pronóstico de ALC varía según la ingesta continua o cesada de alcohol. El alcohol puede influir en la supervivencia y la recompensación en ALC. El alcohol puede influir en el perfil molecular de cada persona con ALC y, por lo tanto, impactar los ingresos hospitalarios, los reingresos y la progresión de la cirrosis hepática.

Un mejor conocimiento del perfil molecular de las personas con ALC, en combinación con las características clínicas del rendimiento físico y de salud del paciente, nos permitirá planificar y administrar acciones de tratamiento personalizado, monitoreo y seguimiento de personas con ALC.

Una visión más profunda de los mecanismos moleculares del hígado que impulsa la progresión y la remisión de la cirrosis, en combinación con datos clínicos, respalda nuestra capacidad para predecir los resultados en la cirrosis, facilitar el monitoreo personalizado y el seguimiento y apoyar el tratamiento derecho y oportuno para el paciente adecuado. Los hallazgos también pueden apoyar el desarrollo de nuevos objetivos de fármacos moleculares para el tratamiento y la prevención de la cirrosis en el futuro.

Métodos El estudio es una cohorte de incidencia en la que los pacientes serán seguidos desde el diagnóstico hasta la muerte o la retirada de la cohorte. Buscaremos incluir pacientes consecutivamente dentro de los tres meses posteriores al diagnóstico. Los resultados se informarán después de las directrices estroboscópicas.

Estudia a los sujetos a todas las personas con una referencia inicial a la investigación para y diagnóstico de cirrosis hepática relacionada con el alcohol en la unidad gastrográfica, y todos los pacientes con un debut sobre la cirrosis hepática relacionada con el alcohol durante el ingreso, independientemente del motivo de la admisión, son elegibles para la inclusión.

Este estudio no compromete el diagnóstico o el tratamiento de la cirrosis o las comorbilidades, y es posible la inclusión en estudios intervencionistas durante el seguimiento prospectivo.

Reclutamiento de todos los pacientes con un debut de cirrosis hepática sospecha que está relacionado con el uso del alcohol, y independientemente del tiempo y las circunstancias de diagnóstico, comorbilidades y gravedad de la enfermedad se ofrecerán inclusión en la cohorte. Todos los participantes serán contratados por el médico o la enfermera que brinda un estándar de atención. Todos los participantes serán informados por escrito, así como por vía oral por investigadores de estudio y enfermeras de proyectos.

Intervención para dejar de alcohol y estándar de atención a todos los pacientes con ALC tratados en la unidad gastro, AHH y, por lo tanto, a todos los participantes en este estudio se les ofrecerá el estándar de tratamiento de atención. Esto incluye investigaciones con bioquímica estándar, ultrasonido, fibroscán, CT-scan y endoscopia, así como suplementos nutricionales, tratamiento médico para cirrosis y complicaciones, y comorbilidades.

La intervención para dejar de alcohol se ofrecerá como estándar de tratamiento de atención a todos los pacientes con ALC. La intervención incluye el tratamiento médico de los síntomas de abstinencia y el anhelo, y el apoyo a la derivación a las ofertas municipales de tratamiento de alcohol. Además, con el objetivo de facilitar el cese de alcohol y apoyar más tratamiento con alcohol en el sector primario, a los pacientes se les ofrecerá entrevistas motivacionales (IM) como parte de su tratamiento.

Los pacientes y los posibles cuidadores serán invitados a tres sesiones de MI realizadas por enfermeras especializadas en la clínica hepática dentro de los primeros tres meses posteriores al diagnóstico.

Datos de las revistas del paciente En este estudio recuperaremos información de la revista del paciente después de que se proporcione el consentimiento por escrito.

Los datos recuperados de las revistas del paciente antes de obtener el consentimiento se limitan al diagnóstico de ALC, el tiempo del diagnóstico y la causa del ingreso hospitalario o la derivación que condujo al diagnóstico de ARLD. Los datos biométricos obtenidos antes del consentimiento por escrito de participación no se recuperarán para el estudio. Estos datos pueden recopilarse de un período de cero a treinta días antes de la inclusión y se transmitirán a investigadores clínicos y al personal del estudio.

Los datos y la información personal se registran y monitorean después de la legislación actual, la Ley de Protección de Datos y como lo indica el Reglamento General de Protección de Datos.

Análisis genéticos El ADN se extraerá de células sanguíneas, sangre completa y de las heces de los participantes. El ADN se almacenará a -80 ° C, hasta un análisis posterior. El genotipado se realizará con un GWAS-chip (es decir, Mapeo genómico dirigido) utilizando Illumina Exomechip enriquecido para variantes de efecto grande que cambian proteínas. Las variantes ultra-raras (<1/1000) no serán capturadas. Los resultados de los análisis genéticos combinados con datos clínicos pueden identificar genes asociados con la mortalidad, la supervivencia y la gravedad de la enfermedad en un contexto de "perfil de riesgo". El análisis genómico comprende variantes comunes y el perfil de puntuación de riesgo poligénico en variantes comunes. No se realizará la secuenciación del genoma completo.

Los análisis genéticos sobre el ADN bacteriano de las heces se utilizarán para análisis comparativos de la interacción entre la disfunción intestinal y la cirrosis hepática.

La transcriptómica, la metabolómica y la proteómica para la identificación de nuevos marcadores potenciales involucrados en el desarrollo, progresión y remisión de ALC, transcriptómica, metabolómica y proteómica se realizarán en el tejido hepático y la sangre. Los análisis evaluarán los niveles de expresión y la localización celular de posibles biomarcadores, incluidos receptores y ligandos, así como moléculas de señalización aguas abajo. Las técnicas aplicadas se describen a continuación. Junto con los datos clínicos, los resultados mejorarán la comprensión de los posibles impulsores para la remisión y la progresión de ARLD.

El campo de descubrimiento de las tenchnologías de Omics está evolucionando rápidamente, y los métodos pueden estar sujetos a adaptaciones para asegurar la calidad, la relevancia y los mejores premios para el análisis.

El análisis de análisis de proteómica de muestras de plasma garantiza una alta tasa de éxito y los pacientes son fácilmente tolerar fácilmente el muestreo a lo largo del tiempo. Las biopsias de hígado congeladas por SNAP se recolectarán al inicio y a los 12 meses para el análisis. La preparación de muestras y la cromatografía líquida y el análisis de espectrometría de masas (LC/MS) seguirán las tecnologías descritas previamente de Torben Hansen y el Centro de Investigación Metabólica Básica (CBMR), Universidad de Copenhague. En el análisis de proteoma plasmático de un solo disparo, la mezcla de péptidos se eluye Evosep One LC System (Evosep Biosystems) acoplado en línea a un espectrómetro de masas ORBITRAP Exploris 480.

Análisis de lipidómica:

El análisis se realiza de acuerdo con los procedimientos existentes de última generación y se modifica para aplicar la mejor tecnología disponible.

Después de la preparación de plasma, la separación cromatográfica se realiza en la columna de Waters Acquity BEH BEH C18 (1.7 μm x 2.1 mm x 100 mm) utilizando el gradiente de dos fases móviles estándar (la fase móvil A contiene agua, ácido fórmico y 10 ml de acetato de amonio acetato, el acetato de fase m móvil compone isopropanol y acetonitrilo (1: 1) con la misma adición de ácido de fórmico y amonio, y amonium).

La identificación de espectrometría de masas de compuestos se dirige a base en una biblioteca prefabricada de metabolitos objetivo en plasma.

Según los resultados de los análisis de lipidómica, seleccionaremos un panel de marcadores de diagnóstico, que describirá de manera más eficiente la velocidad de la progresión de la enfermedad. Para los biomarcadores seleccionados desarrollaremos un método cuantitativo absoluto, basado en la metodología LC-MS-MS (triple cuadrupolo MS en modo MRM), utilizando compuestos estándar disponibles comercialmente, incluidos los compuestos etiquetados por isótopos estables como estándares internos. El método se validará de acuerdo con los protocolos estandarizados. En el caso de resultados exitosos, podremos establecer límites de concentración de los biomarcadores de paneles para la predicción de la progresión de la enfermedad lenta, media y rápida, así como en el método a largo plazo listo para transferir a laboratorios clínicos y medicina personalizada.

El análisis biológico y el manejo de datos de proteómica y lipidómica tendrán lugar en el CBMR.

Los análisis de análisis de transcriptomómica y bioestadística se realizarán en el Centro de Investigación Metabólica Básica.

La secuenciación de ARN a granel proporciona un panorama de transcripción de todo el tejido y permite una investigación profunda sobre el transcriptoma, pero no distingue entre las células individuales. Para identificar genes que juegan un papel importante en la progresión o la recompensación de AH, compararemos los conjuntos de datos de la secuenciación de ARN a granel en AH hasta conjuntos de datos ya establecidos desde la secuenciación de RNS de células individuales del hígado.

Basado en genes que son sugeridos simultáneamente por el ARN a granel en nuestras muestras y SCRNaseQ, podemos explorar los reguladores transcripcionales clave en ALC.

Haremos uso de este recurso para desconvolutar computacionalmente los datos del transcriptoma a granel de las biopsias hepáticas para estimar la abundancia relativa de cada tipo de célula del hígado (hepatocitos, células esteladas hepáticas, células epiteliales hepáticas sinusoidales, etc.) en cada paciente. Se evaluarán posibles reguladores de enfermedades de progresión y recompensación.

Biobank de investigación Se establecerá un biobanco para el estudio. El biobanco contendrá sangre recolectada al inicio, tres meses, 1 y 3 años, y el tejido hepático y las heces recolectadas al inicio y después de 1 año. En cada punto de tiempo, se recogen 15 ml de sangre y 3 gramos de heces. Al inicio y después de 1 año se recolectarán 0,2 gramos de tejido hepático. Si un participante tiene ascitis y necesita paracentesis, se tomará una biopsia de grasa subcutánea del punto de incisión en el abdomen.

El material excedente del estudio se transferirá a un biobanco para futuras investigaciones.

Perspectivas El estudio contribuirá a una mejor caracterización de la enfermedad hepática avanzada relacionada con el alcohol y contribuirá a una mejor organización futura de las ofertas de tratamiento y rehabilitación a pacientes con enfermedad hepática. La caracterización exhaustiva y la inclusión consecutiva mejorarán nuestra comprensión sobre la incidencia, la prevalencia y el impacto de ALC en la población, así como la utilización de recursos de atención médica asignados a su tratamiento.

Una visión más profunda de los mecanismos moleculares de la progresión y la remisión del hígado, en combinación con los datos clínicos, apoyará nuestra capacidad de predecir los resultados en la cirrosis, facilitará el monitoreo personalizado para proporcionar el tratamiento adecuado para el paciente adecuado en el momento correcto.

El estudio de cohorte prospectivo contribuirá aún más a la identificación de factores de riesgo previamente no identificados significativos para la supervivencia y el uso de servicios de atención médica; y así formar la base de implementar cambios en las prácticas de salud que ofrecen beneficios económicos y médicos. Además, el estudio puede descubrir nuevas áreas para la investigación intervencionista con puntos finales clínicamente relevantes.