Remissione ottimizzata nella cirrosi epatica correlata all'alcool (Pro-ALC)

In Danimarca l'incidenza della cirrosi epatica è aumentata di cinque volte per gli uomini e triplicata per le donne negli ultimi quarant'anni. Nel 2008 è stata diagnosticata circa 15.000 persone con cirrosi epatica. I pazienti che vengono riammessi in ospedale hanno una mortalità più alta di 90 giorni rispetto a quelli che evitano la riammissione.

Il decorso clinico della cirrosi epatica comprende complicanze dell'ascite, encefalopatia epatica, sanguinamento variceo, disfunzione renale e infezioni con ripetute ammissioni all'ospedale che peggiorano la prognosi. Queste complicanze sono guidate dallo sviluppo dell'ipertensione portale nel fegato. Questa progressione nella fase "scompensata" è considerata un segno distintivo nel corso della malattia, poiché la decompensa è associata a un rischio notevolmente aumentato di ulteriori complicanze e morte.

Diversi studi clinici hanno cercato di trovare rimedi medici che prevengano complicanze legate all'ipertensione portale o rallentano ulteriori progressi nella cirrosi. Tuttavia, un'evidenza crescente indicano che le misure attive del trattamento della causa sottostante della malattia epatica e la rimozione degli agenti tossici che causano cirrosi possono rallentare la progressione della malattia o addirittura indurre la regressione della cirrosi. Questo concetto è descritto come ricompensa epatica.

Le caratteristiche cliniche e biochimiche come i livelli di BMI e albumina possono essere collegate alla ricompensa, ma c'è una marcata necessità di studi clinici che studiano nuovi biomarcatori con la capacità di prevedere e monitorare il miglioramento della cirrosi epatica, e senza l'impatto dell'alcol.

Tra il 75% e l'80% dei pazienti con cirrosi epatica in Danimarca ha o hanno avuto un uso dannoso di alcol. La dipendenza dell'alcol porta all'isolamento sociale, al rischio di disoccupazione e una riduzione della conformità dell'assistenza sanitaria (8). La cirrosi è correlata alla riduzione della qualità della vita e colpisce i pazienti e i parenti sia emotivi che socioeconomici.

La malattia epatica correlata all'alcol (ARLD) ha un impatto notevole sulla salute e sulla vita dei pazienti e il trattamento ruota attorno al sollievo sintomatico e alla prevenzione di ulteriori complicanze. Vi è una necessità insoddisfatta di studiare le opzioni terapeutiche che non solo alleviano le complicanze, ma affrontano anche i percorsi sottostanti della malattia epatica legata all'alcol, anche nelle gravi fasi della cirrosi correlata all'alcol (ALC). Precedenti studi che esplorano la ricompensa in ARLD sono retrospettivi e non progettati per lo scopo esatto.

Fattori come l'IMC, il genere femminile e l'ipertensione portale minore sono noti per essere associati a una maggiore probabilità di ricompensa. Ulteriori fattori di attivazione genetica e biomarcatori molecolari del proteoma e del lipidoma hanno attirato solo l'attenzione minore e non sono stati affrontati l'impatto del trattamento dei driver di decompensione, ipertensione portale e uso di alcol e il loro impatto sulla causa naturale della malattia.

L'unità Gastro, Amager-Hvidovre Hospital (AHH) ha un'area record di 550.000 cittadini a sud e ad ovest di Copenaghen. L'unità Gastro è la più grande in Danimarca, con app. 90 ammissioni ogni giorno. A 140 persone viene diagnosticata la cirrosi epatica ogni anno nel nostro dipartimento, a causa del referral o dal debutto della malattia durante il ricovero in ospedale. Da novembre 2019 a marzo 2022, 357 pazienti sono stati valutati per la cirrosi epatica nell'unità gastro. Il 20 % di questi è morto entro dodici mesi. Il 75% aveva l'uso di alcol come causa principale della cirrosi epatica.

Nuove tecnologie molecolari e previsione del rischio La patofisiologia molecolare di ARLD è compresa in modo incompleto. La caratterizzazione della dinamica del proteoma attraverso lo spettro dell'ALD potrebbe fornire nuove intuizioni sui meccanismi della malattia sia di progressione che di remissione della malattia. I recenti progressi nella proteomica a base di SM hanno notevolmente esteso il suo impatto nella ricerca biomedica e clinica. Consente l'identificazione e la quantificazione di migliaia di proteine, rendendolo adatto per lo studio di meccanismi di malattia e l'identificazione dei biomarcatori. Precedenti studi hanno valutato il proteoma nella malattia epatica steatotica associata alla disfunzione metabolica (MASH) e alla fibrosi correlata all'alcol e i profili proteomici hanno mostrato una forte associazione alla gravità della malattia epatica. Mancano studi con follow-up consecutivi nelle gravi fasi di ALC.

La proteomica basata su MS può identificare i biomarcatori del valore predittivo nella clinica, in particolare nella prospettiva di remissione della malattia. Il collegamento ai dati e ai risultati clinici può supportare l'uso di biomarcatori proteomici nella previsione e nel monitoraggio della remissione in AH e nella ricompensa in ALC.

Numerosi marcatori di infiammazione e citochine sono coinvolti nella guida della decompensione e hanno il potenziale per prevedere il rischio di morte precoce. Non è noto se tali marcatori possano prevedere la remissione e la ricompensa in ALC e AH. Studi precedenti hanno valutato le relazioni tra infiammazione e mortalità, ma sono mancanti studi prospettici che studiano le associazioni tra biomarcatori di metabolismo e prognosi, monitoraggio e trattamento di efficacia OG in ALC.

Trascrittomica e attivazione genica nella progressione e nella remissione della malattia epatica La complessità molecolare e cellulare del microambiente epatico rimane un ostacolo chiave che ostacola lo sviluppo di potenziali trattamenti. Precedenti studi sul sequenziamento dell'RNA sono piccoli e senza follow-up.

Con i progressi nei chip genici e nel sequenziamento ad alto rendimento, sono state stabilite diverse firme geniche prognostiche per prevedere la sopravvivenza globale nella cirrosi epatica.

Recenti sequenziamento dell'RNA a cellule singolo e studi di sequenziamento dell'RNA sfuso hanno dimostrato che specifici lignaggi mesenchimali, endoteliali e monociti sono arricchiti nei fegati cirrotici.

Il sequenziamento dell'RNA del tessuto intero (in blocco) fornisce una lettura media del contenuto di RNA di un campione, che rappresenta segnali di RNA misti delle diverse cellule presenti all'interno del tessuto ed è quindi significativamente influenzato dalla prevalenza del tipo di cellula. Rispetto al sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scrNA-seq), il sequenziamento dell'RNA in blocco non può essere usato per studiare popolazioni cellulari rare o sottopopolazioni specifiche di cellule patogene, ma fornisce informazioni su modelli di trascrizione del gene patogeno e disfunzione cellulare, specialmente se collegate al fenotipo clinico e se confrontato con una libreria scrNA.

Nessuno studio ha precedentemente confrontato i cambiamenti nel trascrittoma dopo la rimozione degli agenti tossici causando danni al fegato.

In ALC, c'è una necessità insoddisfatta di studiare le opzioni di trattamento che affrontano i percorsi sottostanti dell'ARLD, anche nelle gravi fasi della cirrosi. L'induzione della ricompensa prolungherà sia la sopravvivenza che la vita quotidiana "priva di ammissione" dei pazienti con ALC.

Obiettivi L'obiettivo generale del presente studio è di studiare il profilo molecolare e i percorsi nelle persone con ALD per supportare il monitoraggio personalizzato e il follow-up nella cirrosi epatica.

Ipotesi La prognosi di ALC varia a seconda dell'assunzione di alcol continua o cessata. L'alcol può influenzare la sopravvivenza e la ricompensa in ALC. L'alcol può influenzare il profilo molecolare di ogni persona con ALC e quindi influire sulle ammissioni ospedaliere, le riammissioni e la progressione della cirrosi epatica.

Una migliore conoscenza del profilo molecolare delle persone con ALC sarà, in combinazione con le caratteristiche cliniche della salute e delle prestazioni fisiche del paziente, ci consente di pianificare e somministrare azioni di trattamento personalizzato, monitoraggio e follow-up delle persone con ALC.

Una visione più approfondita dei meccanismi molecolari della progressione e della remissione della cirrosi e del fegato, in combinazione con i dati clinici, supporterà la nostra capacità di prevedere i risultati nella cirrosi, faciliterà il monitoraggio personalizzato e il follow-up e supportare il trattamento giusto e tempestivo per il paziente giusto. I risultati possono anche supportare lo sviluppo di nuovi obiettivi di farmaci molecolari per il trattamento e la prevenzione della cirrosi in futuro.

Metodi Lo studio è una coorte di incidenza in cui i pazienti saranno seguiti dalla diagnosi alla morte o dal ritiro dalla coorte. Cercheremo di includere i pazienti consecutivamente entro tre mesi dalla diagnosi. I risultati saranno riportati dopo le linee guida strobe.

Studio soggetti tutte le persone con un riferimento iniziale all'indagine per e diagnosi di cirrosi epatica correlata all'alcol nell'unità gastro e tutti i pazienti con un debutto sulla cirrosi epatica legata all'alcol durante l'ammissione indipendentemente dal motivo dell'ammissione, sono idonei per l'inclusione.

Questo studio non compromette la diagnostica o il trattamento della cirrosi o delle comorbidità e l'inclusione negli studi interventistici durante il follow-up prospettico è possibile.

Assunzione di tutti i pazienti con un debutto sulla cirrosi epatica sospettata di essere correlati all'uso di alcol e, indipendentemente dal tempo e dalle circostanze della diagnosi, delle comorbilità e della gravità della malattia, saranno offerti inclusione nella coorte. Tutti i partecipanti saranno coinvolti dal medico o dall'infermiera che forniscono standard di cure. Tutti i partecipanti saranno informati per iscritto, nonché per via orale da investigatori di studio e infermieri del progetto.

Intervento di cessazione dell'alcool e standard di cura Tutti i pazienti con ALC trattati nell'unità Gastro, AHH, e pertanto a tutti i partecipanti a questo studio verrà offerto il trattamento standard di cure. Ciò include indagini con biochimica standard, ultrasuoni, fibroscan, CT-scan e endoscopia, nonché integratori nutrizionali, cure mediche per cirrosi e complicanze e comorbilità.

L'intervento di cessazione dell'alcool sarà offerto come un trattamento di serie di cure per tutti i pazienti con ALC. L'intervento include il trattamento medico dei sintomi di astinenza e la brama e il sostegno ai referral alle offerte municipali del trattamento dell'alcol. Inoltre, con l'obiettivo di facilitare la cessazione dell'alcol e di sostenere ulteriori trattamenti alcolici nel settore primario, ai pazienti verrà offerto un intervista motivazionale (MI) come parte del loro trattamento.

I pazienti e i possibili caregiver saranno invitati a tre sessioni di Mi condotte da infermieri specializzati nella clinica epatica entro i primi tre mesi dopo la diagnosi.

I dati delle riviste dei pazienti in questo studio recupereremo informazioni dal diario dei pazienti dopo che viene fornito il consenso scritto.

I dati recuperati dalle riviste dei pazienti prima di ottenere il consenso sono limitati alla diagnosi di ALC, al tempo della diagnosi e alla causa del ricovero ospedaliero o del rinvio che ha portato alla diagnosi di ARLD. I dati biometrici ottenuti prima del consenso scritto alla partecipazione non saranno recuperati per lo studio. Questi dati possono essere raccolti da un periodo da zero a trenta giorni prima dell'inclusione e saranno trasmessi agli investigatori del medico e al personale di studio.

I dati e le informazioni personali sono registrati e monitorati dopo l'attuale legislazione, la legge sulla protezione dei dati e, come indicato dal regolamento generale sulla protezione dei dati.

Le analisi genetiche del DNA verranno estratte dalle cellule del sangue, nel sangue intero e dalle feci dei partecipanti. Il DNA verrà conservato a -80c, fino a ulteriori analisi. La genotipizzazione verrà eseguita con un chip GWAS (cioè Mappatura genomica mirata) Utilizzo di Illumina Exomechip arricchita per varianti di grande effetto che cambiano proteina. Le varianti ultra-rare (<1/1000) non saranno catturate. I risultati delle analisi genetiche combinate con i dati clinici possono identificare i geni associati alla mortalità, alla sopravvivenza e alla gravità della malattia in un contesto di "profilazione del rischio". L'analisi genomica comprende varianti comuni e profilazione del punteggio di rischio poligenico su varianti comuni. Il sequenziamento dell'intero genoma non verrà eseguito.

Le analisi genetiche sul DNA batterico dalle feci verranno utilizzate per analisi comparative dell'interazione tra disfunzione intestinale e cirrosi epatica.

Trascrittomica, metabolomica e proteomica per l'identificazione di nuovi potenziali marcatori coinvolti nello sviluppo, nella progressione e nella remissione di ALC, trascrittomica, metabolomica e proteomica saranno eseguiti su tessuto epatico e sangue. Le analisi valuteranno i livelli di espressione e la localizzazione cellulare di possibili biomarcatori tra cui recettori e ligandi, nonché molecole di segnalazione a valle. Le tecniche applicate sono descritte di seguito. Insieme ai dati clinici, i risultati miglioreranno la comprensione dei possibili driver per la remissione e la progressione di ARLD.

Il campo delle omiche di scoperta Tenchnologies è in rapido evoluzione e i metodi possono essere soggetti ad adattamenti per la qualità, la pertinenza e i migliori premi per l'analisi.

L'analisi dell'analisi della proteomica dei campioni di plasma garantisce un alto tasso di successo e il campionamento ripetuto nel tempo è facilmente tollerata dai pazienti. Le biopsie epatiche a scatto-Frozen saranno raccolte al basale e a 12 mesi per l'analisi. La preparazione di campioni e cromatografia liquida e analisi di spettrometria di massa (LC/MS) seguirà le tecnologie precedentemente descritte da Torben Hansen e Center for Basic Metabolic Research (CBMR), Copenhagen University. Nell'analisi del proteoma plasmatico a colpo singolo, la miscela peptidica è eluita il sistema LC EVOSEP One LC (EVOSEP BIOSSYSTESS) accoppiato online a uno spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480.

Analisi lipidomiche:

L'analisi viene eseguita in base alle procedure esistenti all'avanguardia e modificata per applicare la migliore tecnologia disponibile.

Dopo la preparazione al plasma, la separazione cromatografica viene eseguita sulla colonna di acquisizione delle acque Beh C18 (1,7 μm x 2,1 mm x 100 mm) usando il gradiente di due fasi mobili standard (fase mobile A contiene acqua, 0,1% di acido formico e acetato di ammonio 1m di ammonio, acetato di ammonio 1m di ammonio di ammonio).

L'identificazione della spettrometria di massa dei composti è mirata in base a una libreria prefabbricata di metaboliti target nel plasma.

Sulla base dei risultati delle analisi lipidomiche, selezioneremo un gruppo di marcatori diagnostici, che descriverà in modo più efficiente la velocità della progressione della malattia. Per i biomarcatori selezionati svilupperemo un metodo quantitativo assoluto, basato sulla metodologia LC-MS-MS (tripla quadrupolo MS in modalità MRM), utilizzando composti standard disponibili in commercio, inclusi i composti etichettati di isotopi stabili come standard interni. Il metodo verrà validato in base ai protocolli standardizzati. Nel caso di risultati positivi, saremo in grado di impostare i limiti di concentrazione dei biomarcatori del panel per la previsione della progressione della malattia lenta, media e veloce, oltre a lungo termine, rendere il metodo pronto a trasferirsi in laboratori clinici e medicina personalizzata.

L'analisi biologica e la gestione dei dati della proteomica e della lipidomica avranno luogo al CBMR.

Le analisi delle analisi trascrittomomiche e la biostatistica saranno eseguite al Center for Basic Metabolic Research.

Il sequenziamento dell'RNA in blocco fornisce un panorama di trascrizione a livello di tessuto e consente una profonda indagine sul trascrittoma, ma non distingue tra le singole cellule. Per identificare i geni che svolgono un ruolo importante nella progressione o nella ricompensa di AH, confronteremo i set di dati dal sequenziamento dell'RNA in serie in AH con set di dati già stabiliti dal sequenziamento RNS a cella singola del fegato.

Sulla base di geni che sono contemporaneamente suggeriti da Bulk-RNA nei nostri campioni e ScRNaseq, possiamo esplorare i regolatori trascrizionali chiave in ALC.

Faremo uso di questa risorsa per deconvolare computazionalmente i dati del trascrittoma di massa delle biopsie epatiche per stimare l'abbondanza relativa di ciascun tipo di cellula del fegato (epatocita, cellule stellate epatiche, cellule epiteliali sinusoidali epatiche, ecc.) In ogni paziente. Saranno valutati possibili regolatori della malattia sia della progressione che della ricompensa.

Research Biobank Una biobanca sarà stabilita per lo studio. La biobanca conterrà sangue raccolto al basale, tre mesi, 1 e 3 anni e tessuto e fegato epatico raccolti al basale e dopo 1 anno. Ad ogni momento, vengono raccolti 15 ml di sangue e 3 grammi di feci. Al basale e dopo 1 anno verranno raccolti 0,2 grammi di tessuto epatico. Se un partecipante ha ascite e ha bisogno di paracentesi, una biopsia grassa sottocutanea verrà presa dal punto di incisione sull'addome.

Il materiale in eccesso dello studio verrà trasferito a una biobanca per la ricerca futura.

Prospettive Lo studio contribuirà a una migliore caratterizzazione della malattia epatica avanzata correlata all'alcol e contribuirà a una migliore organizzazione futura di offerte di trattamento e riabilitazione ai pazienti con malattia epatica. La caratterizzazione approfondita e l'inclusione consecutiva miglioreranno la nostra comprensione sull'incidenza, la prevalenza e l'impatto dell'ALC nella popolazione, nonché l'utilizzo delle risorse sanitarie assegnate al suo trattamento.

Una visione più profonda dei meccanismi molecolari della progressione e della remissione epatica, in combinazione con i dati clinici, supporterà la nostra capacità di prevedere i risultati nella cirrosi, facilitare il monitoraggio personalizzato che mira a fornire il trattamento giusto per il paziente giusto al momento giusto.

Lo studio di coorte prospettico contribuirà ulteriormente all'identificazione di fattori di rischio precedentemente non identificati per la sopravvivenza e all'uso dei servizi sanitari; e quindi costituisce la base dell'attuazione dei cambiamenti nelle pratiche sanitarie che offrono benefici economici e medici. Inoltre, lo studio può scoprire nuove aree per la ricerca interventistica con endpoint clinicamente rilevanti.