Zoptymalizowana remisja w wątrobie związanej z alkoholem (Pro-ALC)

W Danii występowanie marskości wątroby wzrasta pięciokrotnie dla mężczyzn i potroiła się dla kobiet w ciągu ostatnich czterdziestu lat. W 2008 r. Zdiagnozowano marskość wątroby w około 15 000 osób. Pacjenci, którzy zostali przyjęci do szpitala, mają wyższą 90-dniową śmiertelność niż ci, którzy unikają readmisji.

Kliniczny przebieg marskości wątroby obejmuje powikłania wodobrzusza, encefalopatię wątroby, krwawienie z żyłami, dysfunkcję nerek i infekcje powtarzającymi się przyjęciami do szpitala, które znacznie pogarszały rokowanie. Powikłania te wynikają z rozwoju nadciśnienia portalowego w wątrobie. Ta progresja do etapu „dekompensowanego” jest uważana za znak charakterystyczny w trakcie choroby, ponieważ dekompensacja wiąże się z znacznie zwiększonym ryzykiem dalszych powikłań i śmierci.

Kilka badań klinicznych miało na celu znalezienie środków medycznych, które zapobiegają powikłaniom związanym z nadciśnieniem portalowym lub spowolnić dalszy postęp w marskości wątroby. Jednak rosnące dowody wskazują, że aktywne pomiary leczenia podstawowej przyczyny choroby wątroby i usunięcie toksycznych środków powodujących marskość wątroby mogą spowolnić postęp choroby, a nawet wywołać regresję marskości wątroby. Ta koncepcja jest opisywana jako rekompensata w wątrobie.

Cechy kliniczne i biochemiczne, takie jak poziomy BMI i albuminy, mogą być powiązane z rekompensatą, ale istnieje wyraźna potrzeba badań klinicznych badających nowe biomarkery z możliwością przewidywania i monitorowania poprawy marskości wątroby, z i bez wpływu alkoholu.

Od 75% do 80% pacjentów z marskością wątroby w Danii miało lub miało szkodliwe użycie alkoholu. Zależność alkoholu prowadzi do izolacji społecznej, ryzyka bezrobocia i zmniejszonej przestrzegania opieki zdrowotnej (8). Marskość jest związana ze zmniejszoną jakością życia i wpływa na pacjentów i krewnych zarówno emocjonalnych, jak i społeczno -ekonomicznych.

Choroba wątroby związana z alkoholem (ARLD) ma znaczący wpływ na zdrowie i życie pacjentów, a leczenie dotyczy objawowych ulgi i zapobiegania dalszym powikłaniom. Istnieje niezbędna potrzeba zbadania opcji leczenia, które nie tylko łagodzą powikłania, ale także zajmują się podstawowymi ścieżkami choroby wątroby związanej z alkoholem, również w ciężkich stadiach marskości wątroby związanych z alkoholem (ALC). Poprzednie badania badające rekompensatę w ARLD są retrospektywne i nie są przeznaczone do dokładnego celu.

Czynniki takie jak BMI, płeć żeńska i niewielkie nadciśnienie wrotne są powiązane ze zwiększonym prawdopodobieństwem rekompensaty. Dodatkowe czynniki aktywacji genetycznej i biomarkerów molekularnych z proteomu i lipidomu tylko nie przyciągnęły niewielkiej uwagi, a wpływ leczenia napędzających dekompensację, nadciśnienia wrotne i używania alkoholu oraz ich wpływ na naturalną przyczynę choroby.

Jednostka Gastro, Amager-Hvidovre Hospital (AHH) ma rekordową powierzchnię 550 000 obywateli na południe i zachód od Kopenhagi. Jednostka Gastro jest największa w Danii, z aplikacją. 90 przyjęć codziennie. 140 osób zdiagnozowano marskość wątroby rocznie na naszym dziale, według skierowania od ogólnej praktyki lub debiutu choroby podczas przyjęcia szpitala. Od listopada 2019 r. Do marca 2022 r. Oceniono 357 pacjentów pod kątem marskości wątroby w oddziale żołądkowo -żołądkowo -żołądkowo 20 % z nich zmarło w ciągu dwunastu miesięcy. 75% miało spożywanie alkoholu jako podstawową przyczynę marskości wątroby.

Nowe technologie molekularne i przewidywanie ryzyka Patofizjologia molekularna ARLD jest niekompletnie rozumiana. Charakterystyka dynamiki proteomu w spektrum ALD może zapewnić nowy wgląd w mechanizmy choroby zarówno progresji, jak i remisji choroby. Ostatnie postępy w proteomice opartej na MS znacznie rozszerzyły jej wpływ na badania biomedyczne i kliniczne. Umożliwia identyfikację i kwantyfikację tysięcy białek, dzięki czemu nadaje się do badania mechanizmów choroby i identyfikacji biomarkerów. Wcześniejsze badania oceniono proteom w zaburzeniach metabolicznych związanych z chorobą steatotyczną wątroby związanej z zaburzeniami czynności (MASH) i zwłóknienia alkoholu, a profile proteomiczne wykazały silny związek z ciężkością choroby wątroby. Nadal brakuje badań z kolejnymi obserwacjami w surowych stadiach ALC.

Proteomika oparta na MS może zidentyfikować biomarkery o wartości predykcyjnej w klinice, szczególnie w perspektywie remisji choroby. Połączenie z danymi klinicznymi i wynikami może wspierać stosowanie biomarkerów proteomicznych w prognozowaniu i monitorowaniu remisji w AH i rekompensaty w ALC.

Kilka markerów stanu zapalnego i cytokin bierze udział w kierowaniu dekompensacją i może przewidzieć ryzyko wczesnej śmierci. Nie wiadomo, czy takie markery mogą przewidzieć remisję i rekompensatę w ALC i AH. Wcześniejsze badania oceniono relacje między stanem zapalnym a śmiertelnością, ale brakuje badań prospektywnych badających powiązania między biomarkerami metabolizmu i prognozowania, monitorowaniem i skutecznością leczenia OG w ALC.

Transkryptomika i aktywacja genów w progresji i remisji choroby wątroby Złożoność molekularna i komórkowa mikrośrodowiska wątrobowego pozostaje kluczową przeszkodą utrudniającą rozwój potencjalnych metod leczenia. Wcześniejsze badania w sekwencjonowaniu RNA są małe i bez obserwacji.

W przypadku postępów w układach genowych i wysokiej przepustowości sekwencjonowania ustalono kilka sygnatur genów prognostycznych w celu przewidywania całkowitego przeżycia w marskości wątroby.

Ostatnie badania sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i masowe sekwencjonowanie RNA wykazały, że specyficzne linie mezenchymalne, śródbłonka i monocytów są wzbogacone w wątrobie marskości wątroby.

Sekwencjonowanie RNA całej tkanki (luzem) zapewnia średni odczyt zawartości RNA próbki, która reprezentuje mieszane sygnały RNA z różnych komórek obecnych w tkance, a zatem ma znaczący wpływ częstość występowania typu komórek. W porównaniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórkowych (SCRNA-Seq), sekwencjonowanie luzem RNA nie można zastosować do badania rzadkich populacji komórek lub specyficznych patogennych subpopulacji komórek, ale zapewnia wgląd w wzorce patogennej transkrypcji genów i dysfunkcji komórkowej, szczególnie gdy jest powiązane z fenotypem klinicznym i w porównaniu z scna-seq.

Żadne badania wcześniej nie porównały zmian w transkryptomie po usunięciu toksycznych środków powodujących uszkodzenie wątroby.

W ALC istnieje niezaspokojona potrzeba zbadania opcji leczenia, które dotyczą podstawowych ścieżek ARLD, również w ciężkich stadiach marskości wątroby. Indukcja rekompensaty przedłuży zarówno przeżycie, jak i „bez wstępu” codzienne życie pacjentów z ALC.

Celem ogólnym celem niniejszego badania jest zbadanie profilu molekularnego i ścieżek u osób z ALD w celu wsparcia spersonalizowanego monitorowania i obserwacji marskości wątroby.

Hipoteza rokowanie ALC różni się w zależności od ciągłego lub zaprzestania spożycia alkoholu. Alkohol może wpływać na przeżycie i rekompensatę w ALC. Alkohol może wpływać na profil molekularny każdej osoby z ALC, a tym samym wpływać na przyjęcie do szpitala, readmisje i postęp marskości wątroby.

Lepsza znajomość profilu molekularnego osób z ALC będzie w połączeniu z cechami klinicznymi zdrowia i wydajności fizycznej pacjenta, umożliwi nam planowanie i administrowanie działaniami spersonalizowanego leczenia, monitorowania i obserwacji osób z ALC.

Głębszy wgląd w mechanizmy molekularne progresji i remisji marskości wątroby spowoduje połączenie z danymi klinicznymi-wspiera naszą zdolność do przewidywania wyników marskości wątroby, ułatwiania spersonalizowanego monitorowania i obserwacji oraz wspierania prawego i terminowego leczenia właściwego pacjenta. Odkrycia mogą również wspierać rozwój nowych celów leków molekularnych w leczeniu i zapobieganiu marskości wątroby w przyszłości.

Metody badanie jest kohortą występowania, w której pacjenci będą przestrzegać diagnozy do śmierci lub wycofania z kohorty. Będziemy starać się uwzględnić pacjentów kolejno w ciągu trzech miesięcy od diagnozy. Wyniki zostaną zgłoszone po wytycznych Strobe.

Badane osoby z początkowym skierowaniem do badań i diagnozy marskości wątroby związanych z alkoholem w oddziale żołądka publicznym oraz wszyscy pacjenci z debiutem marskości wątroby związanych z alkoholem podczas przyjęcia, niezależnie od przyczyny przyjęcia, są uprawnieni do włączenia.

To badanie nie zagraża diagnostyki ani leczenia marskości wątroby lub chorób współistniejących, a możliwe jest włączenie do badań interwencyjnych podczas prospektywnego obserwacji.

Rekrutacja wszyscy pacjenci z debiutem marskości wątroby podejrzanych o spożywanie alkoholu, a niezależnie od czasu i okoliczności diagnozy, choroby współistniejące i nasilenia choroby będą oferowane w kohorcie. Wszyscy uczestnicy będą zaangażowani przez lekarza lub pielęgniarkę zapewniającą standard opieki. Wszyscy uczestnicy zostaną poinformowani na piśmie, a także ustnie przez badaczy badawczych i pielęgniarki projektowe.

Interwencja zaprzestania alkoholu i standard opieki wszyscy pacjenci z ALC leczone w oddziale gastronomicznym, AHH, a zatem wszystkich uczestników tego badania będą oferowani standard leczenia opieki. Obejmuje to badania standardowego biochemii, ultradźwięków, fibroskanu, skanowania CT i endoskopii, a także suplementy diety, leczenie marskości wątroby i powikłań oraz współistniejące.

Interwencja zaprzestania alkoholu będzie oferowana jako standard leczenia opieki wszystkim pacjentom z ALC. Interwencja obejmuje leczenie objawów odstawienia i głodu oraz wsparcie w skierowaniu do ofert miejskich leczenia alkoholu. Ponadto, w celu ułatwienia zaprzestania alkoholu i wspierania dalszego leczenia alkoholu w sektorze pierwotnym, pacjentom otrzymają wywiady motywacyjne (MI) w ramach leczenia.

Pacjenci i potencjalni opiekunowie zostaną zaproszeni na trzy sesje MI przeprowadzone przez wyspecjalizowane pielęgniarki w klinice wątroby w ciągu pierwszych trzech miesięcy po rozpoznaniu.

Dane z czasopism pacjentów W tym badaniu pobramy informacje z czasopisma pacjentów po dostarczeniu pisemnej zgody.

Dane pobrane z czasopism pacjentów przed uzyskaniem zgody są ograniczone do diagnozy ALC, czasu diagnozy i przyczyny przyjęcia szpitala lub skierowania, które doprowadziły do ​​diagnozy ARLD. Dane biometryczne uzyskane przed pisemną zgodą na uczestnictwo nie zostaną odzyskane do badania. Dane te mogą być gromadzone od okresu od zera do trzydziestu dni przed włączeniem i zostaną przekazane badaczom klinicystów i personelu badawczego.

Dane i dane osobowe są rejestrowane i monitorowane po obecnych przepisach, ustawie o ochronie danych oraz zgodnie z ogólnym rozporządzeniem w zakresie ochrony danych.

Analizy genetyczne DNA zostaną ekstrahowane z krwinek, krwi pełnej i ze stołka od uczestników. DNA będzie przechowywane w temperaturze -80 ° C, aż do dalszej analizy. Genotypowanie zostanie wykonywane z chipem GWAS (tj. Ukierunkowane mapowanie genomowe) przy użyciu Illumina ExomeChip wzbogacone w celu zmieniające białko, duży efekty. Ultra-Rare Warianty (<1/1000) nie zostaną uchwycone. Wyniki analiz genetycznych w połączeniu z danymi klinicznymi mogą identyfikować geny związane ze śmiertelnością, przeżyciem i nasileniem choroby w kontekście „profilowania ryzyka”. Analiza genomowa obejmuje wspólne warianty i profilowanie wyników ryzyka poligenicznego na wspólnych wariantach. Sekwencjonowanie całego genomu nie zostanie wykonane.

Analizy genetyczne na bakteryjnym DNA ze stołka zostaną wykorzystane do analiz porównawczych wzajemnego oddziaływania między dysfunkcją jelit a marskością wątroby.

Transkryptomika, metabolomika i proteomika w celu identyfikacji nowych potencjalnych markerów zaangażowanych w rozwój, postęp i remisję ALC, transkryptomiki, metabolomiki i proteomiki zostaną przeprowadzone na tkance wątroby i krwi. Analizy ocenią poziomy ekspresji i lokalizację komórkową możliwych biomarkerów, w tym receptora i ligandów, a także dalszych cząsteczek sygnałowych. Zastosowane techniki opisano poniżej. Wraz z danymi klinicznymi wyniki poprawią zrozumienie możliwych czynników remisji i postępu ARLD.

Tenchnologie OMICS Discovery szybko się rozwija, a metody mogą podlegać adaptacjom bezpiecznej jakości, znaczenia i najlepszych nagród do analizy.

Analiza proteomiczna analiza próbek osocza zapewnia wysoki wskaźnik powodzenia i powtarzające się pobieranie próbek w czasie jest łatwo tolerowane przez pacjentów. Zamorowane biopsje wątroby zostaną zebrane na początku i po 12 miesiącach do analizy. Przygotowanie próbek i analizy chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC/MS) będzie następować technologii opisanych wcześniej z Torben Hansen i Centre for Basic Metabolic Research (CBMR), Uniwersytetu Kopenhagi. W analizie proteomu w osoczu w osoczu pojedynczym mieszaninę peptydową eluowano EVOSEP One LC System (EVOSEP Biosystems) sprzężony online z spektrometrem masowym Exploris 480 Orbitrap Exploris 480.

Analizy lipidomiki:

Analiza jest przeprowadzana zgodnie z najnowocześniejszymi istniejącymi procedurami i modyfikowana w celu zastosowania najlepszej dostępnej technologii.

Po przygotowaniu w osoczu separacja chromatograficzna jest wykonywana na watach kolumny Acquity Beh C18 (1,7 μm x 2,1 mm x 100 mm) przy użyciu gradientu dwóch standardowych faz ruchomych (faza mobilna A zawiera wodę, 0,1% kwasu mrówkowego i 10 ml 1M octanu amonowego, faza mobilna B koncentruje się na izopropanolu i actonelilelu (1: 1) z tym samym dodatkiem kwasu preparkowego i amonum.

Identyfikacja spektrometrii masowych związków jest ukierunkowana na gotową bibliotekę docelowych metabolitów w osoczu.

Na podstawie wyników analiz lipidomicznych wybierzemy panel markerów diagnostycznych, który najskuteczniej opisuje szybkość postępu choroby. W przypadku wybranych biomarkerów opracujemy bezwzględną metodę ilościową, opartą na metodologii LC-MS-MS (Triple Quadrupol MS w trybie MRM), przy użyciu dostępnych w handlu standardowych związków, w tym związków znakowanych stabilnych izotopów jako standardów wewnętrznych. Metoda zostanie zatwierdzona zgodnie ze znormalizowanymi protokołami. W przypadku udanych wyników będziemy w stanie ustalić granice stężenia biomarkerów paneli w celu przewidywania progresji powolnej, średniej i szybkiej choroby, a także w perspektywie długoterminowej, aby metoda gotowa przenieść się do laboratoriów klinicznych i medycyny spersonalizowanej.

Analiza biologiczna i zarządzanie danymi proteomiki i lipidomiki odbędą się w CBMR.

Analizy transkryptomomicznych analizy i biostatystyka zostaną przeprowadzone w Center for Basic Metabolic Research.

Sekwencjonowanie luzem RNA zapewnia krajobraz transkrypcji obejmujący cały tkankę i pozwala na głębokie badanie transkryptomu, ale nie rozróżnia poszczególnych komórek. Aby zidentyfikować geny, które odgrywają ważną rolę w progresji lub rekompensatowaniu AH, porównajmy zestawy danych od sekwencjonowania masowego RNA w AH do już ustalonych zestawów danych z sekwencjonowania RN w pojedynczej komórce wątroby.

Opierając się na genach, które są jednocześnie sugerowane przez lud-RNA w naszych próbkach i scnaseq, możemy zbadać kluczowe regulatory transkrypcji w ALC.

Wykorzystamy ten zasób, aby obliczeniowo dekonluje dane z transkryptomem biopsji wątroby, aby oszacować względną obfitość każdego typu komórkowego wątroby (hepatocyt, wątrobowe komórki gwiaździste, komórek nabłonka sinusoidalnych wątroby itp.). Oceniane zostaną możliwe regulatory choroby zarówno progresji, jak i rekompensaty.

Badania biobank zostanie ustanowiony biobank. Biobank będzie zawierał krew zebraną na początku, trzy miesiące, 1 i 3 lata oraz tkankę wątroby i stołek zebrane na początku i po 1 roku. W każdym punkcie czasowym pobiera 15 ml krwi i 3 gram stolca. Na początku i po 1 roku 0,2 gramu tkanki wątroby. Jeśli uczestnik ma wodobrzusza i potrzebuje paracenteza, z miejsca nacięcia na brzuchu zostanie pobrane podskórne biopsja tłuszczu.

Materiał nadwyżki z badania zostanie przeniesiony na biobank w przyszłych badaniach.

Perspektywy Badanie przyczyni się do lepszej charakterystyki zaawansowanej choroby wątroby związanej z alkoholem i przyczyni się do lepszej przyszłej organizacji ofert leczenia i rehabilitacji dla pacjentów z chorobą wątroby. Dokładna charakterystyka i kolejne włączenie zwiększy nasze zrozumienie częstości występowania, rozpowszechnienia i wpływu ALC w populacji, a także wykorzystanie zasobów opieki zdrowotnej przydzielone na jej leczenie.

Głębszy wgląd w mechanizmy molekularne postępu i remisji wątroby, w połączeniu z danymi klinicznymi, popiera naszą zdolność do przewidywania wyników marskości wątroby, ułatwiania spersonalizowanego monitorowania mającego na celu zapewnienie odpowiedniego leczenia właściwym pacjentem we właściwym czasie.

Badanie prospektywne kohortowe przyczyni się do identyfikacji wcześniej niezidentyfikowanych czynników ryzyka istotnych dla przeżycia i korzystania z usług opieki zdrowotnej; i tym samym stanowią podstawę wprowadzania zmian w praktykach zdrowotnych, które oferują zarówno korzyści ekonomiczne, jak i medyczne. Ponadto badanie może odkryć nowe obszary badań interwencyjnych z klinicznie istotnymi punktami końcowymi.