Remissão otimizada em cirrose hepática relacionada ao álcool (Pro-ALC)

Na Dinamarca, a incidência de cirrose hepática aumenta cinco vezes para homens e triplicou para mulheres nos últimos quarenta anos. Em 2008, aproximadamente 15.000 pessoas foram diagnosticadas com cirrose hepática. Os pacientes que são readmitidos no hospital têm uma mortalidade de 90 dias mais alta do que aqueles que evitam readmissão.

O curso clínico da cirrose hepática inclui complicações de ascite, encefalopatia hepática, sangramento variceal, disfunção renal e infecções com repetidas admissões no hospital que pioram acentuadamente o prognóstico. Essas complicações são impulsionadas pelo desenvolvimento da hipertensão portal no fígado. Essa progressão para o estágio 'descompensado' é considerada uma marca registrada no curso da doença, pois a descompensação está associada a um risco acentuadamente aumentado de complicações e morte adicionais.

Vários estudos clínicos procuraram encontrar remédios médicos que impedissem complicações relacionadas à hipertensão portal ou diminua a progressão adicional na cirrose. No entanto, evidências crescentes indicam que medidas ativas do tratamento da causa subjacente da doença hepática e remoção dos agentes tóxicos que causam cirrose podem retardar a progressão da doença ou até induzir a regressão da cirrose. Este conceito é descrito como recompensação hepática.

Características clínicas e bioquímicas, como IMC e níveis de albumina, podem estar ligadas à recompensação, mas há uma necessidade acentuada de estudos clínicos que investigam novos biomarcadores com a capacidade de prever e monitorar a melhoria na cirrose hepática, com e sem o impacto do álcool.

Entre 75% e 80% dos pacientes com cirrose hepática na Dinamarca tiveram ou tiveram um uso prejudicial de álcool. A dependência do álcool leva ao isolamento social, ao risco de desemprego e à diminuição da conformidade nos cuidados de saúde (8). A cirrose está relacionada à diminuição da qualidade de vida e afeta pacientes e parentes emocionais e socioeconomicamente.

A doença hepática relacionada ao álcool (ARLD) tem um grande impacto na saúde e na vida dos pacientes, e o tratamento gira em torno de alívio sintomático e prevenção de complicações adicionais. Há uma necessidade não atendida de investigar as opções de tratamento que não apenas alivia as complicações, mas também abordam as vias subjacentes da doença hepática relacionada ao álcool, também em estágios graves da cirrose relacionada ao álcool (ALC). Estudos anteriores que exploram a recompensação no ARLD são retrospectivos e não são projetados para o objetivo exato.

Sabe -se que fatores como IMC, gênero feminino e hipertensão portal menor estão associados a uma maior probabilidade de recompensação. Fatores adicionais de ativação genética e biomarcadores moleculares do proteoma e do lipidoma atraíram apenas pequenas atenção, e o impacto do tratamento dos fatores de descompensação, hipertensão portal e uso de álcool e seu impacto na causa natural da doença não foram abordados.

A Unidade Gastro, Hospital Amager-Hvidovre (AHH), possui uma área recorde de 550.000 cidadãos ao sul e oeste de Copenhague. A unidade Gastro é a maior da Dinamarca, com o APP. 90 Admissões diariamente. 140 pessoas são diagnosticadas com cirrose hepática anualmente em nosso departamento, por encaminhamento da prática geral ou pela estréia da doença durante a admissão hospitalar. De novembro de 2019 a março de 2022, 357 pacientes foram avaliados quanto à cirrose hepática na unidade Gastro. 20 % deles morreram dentro de doze meses. 75% tiveram uso de álcool como a principal causa de cirrose hepática.

Novas tecnologias moleculares e previsão de risco A fisiopatologia molecular da ARLD é incompleta. A caracterização da dinâmica do proteoma em todo o espectro da ALD poderia fornecer novas idéias sobre os mecanismos de doença de progressão e remissão da doença. Os recentes avanços na proteômica baseada em EM aumentaram bastante seu impacto na pesquisa biomédica e clínica. Permite a identificação e quantificação de milhares de proteínas, tornando -a adequada para estudar mecanismos de doenças e identificação de biomarcadores. Estudos anteriores avaliaram o proteoma na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASH) e fibrose relacionada ao álcool, e os perfis proteômicos mostraram uma forte associação à gravidade da doença hepática. Estudos com acompanhamento consecutivo nos estágios graves da ALC ainda estão ausentes.

A proteômica baseada na EM pode identificar biomarcadores de valor preditivo na clínica, especialmente na perspectiva de remissão de doença. A ligação a dados e resultados clínicos pode apoiar o uso de biomarcadores proteômicos na previsão e monitoramento da remissão em AH e recompensação na ALC.

Vários marcadores de inflamação e citocinas estão envolvidos na condução de descompensação e têm o potencial de prever o risco de morte precoce. Não se sabe se esses marcadores podem prever remissão e recompensação em ALC e AH. Estudos anteriores avaliaram as relações entre inflamação e mortalidade, mas estudos prospectivos que investigam as associações entre biomarcadores do metabolismo e prognóstico, monitoramento e tratamento de OG em ALC estão ausentes.

Transcriptomics e ativação gênica na progressão e remissão da doença hepática A complexidade molecular e celular do microambiente hepático continua sendo um obstáculo fundamental, dificultando o desenvolvimento de possíveis tratamentos. Estudos anteriores em sequenciamento de RNA são pequenos e sem acompanhamento.

Com os avanços nos chips de genes e no seqüenciamento de alto rendimento, várias assinaturas de genes prognósticas foram estabelecidas para prever a sobrevida global na cirrose hepática.

Estudos recentes de sequenciamento de RNA de célula única e sequenciamento de RNA a granel mostraram que linhagens mesenquimais, endoteliais e monócitos específicas são enriquecidas em fígados cirróticos.

O sequenciamento de RNA de tecido inteiro (a granel) fornece uma leitura média do teor de RNA de uma amostra, que representa sinais de RNA mistos das diferentes células presentes no tecido e, portanto, são significativamente influenciadas pela prevalência do tipo de célula. Comparado ao seqüenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), o sequenciamento de RNA a granel não pode ser usado para estudar populações de células raras ou subpopulações de células patogênicas específicas, mas fornece informações sobre padrões de transcrição gênica patogênica e disfunção celular, especialmente quando vinculados ao fenótipo clínico e quando comparado a a liblioteca de ScRNA-seq seq da Library da Library do Liberário Limal.

Nenhum estudo já comparou alterações no transcriptoma após a remoção dos agentes tóxicos, causando danos no fígado.

Na ALC, há uma necessidade não atendida de investigar as opções de tratamento que abordam as vias subjacentes do ARLD, também em estágios graves de cirrose. A indução da recompensação prolongará a sobrevivência e a vida cotidiana 'livre de admissão' de pacientes com ALC.

Objetivos O objetivo geral do presente estudo é investigar o perfil molecular e as vias em pessoas com ALD para apoiar o monitoramento e acompanhamento personalizados na cirrose hepática.

Hipótese O prognóstico da ALC varia de acordo com a ingestão contínua ou interrompida de álcool. O álcool pode influenciar a sobrevivência e a recompensação na ALC. O álcool pode influenciar o perfil molecular de cada pessoa com ALC e, portanto, impactar as admissões hospitalares, readmissões e progressão da cirrose hepática.

O melhor conhecimento do perfil molecular de pessoas com ALC, em combinação com as características clínicas do desempenho e desempenho físico do paciente, nos permitirá planejar e administrar ações de tratamento personalizado, monitoramento e acompanhamento de pessoas com ALC.

Uma visão mais profunda dos mecanismos moleculares da progressão do fígado e a remissão de cirrose-em combinação com dados clínicos-apoiará nossa capacidade de prever resultados na cirrose, facilitará o monitoramento e o acompanhamento personalizados e apoiar o tratamento certo e oportuno para o paciente certo. Os resultados também podem apoiar o desenvolvimento de novos alvos moleculares de medicamentos para tratamento e prevenção da cirrose no futuro.

Métodos O estudo é uma coorte de incidência na qual os pacientes serão seguidos do diagnóstico até a morte ou a retirada da coorte. Procuraremos incluir pacientes consecutivamente dentro de três meses após o diagnóstico. Os resultados serão relatados após as diretrizes do estroboscópio.

Os sujeitos do estudo todas as pessoas com uma indicação inicial à investigação e diagnóstico de cirrose hepática relacionada ao álcool na unidade gastronômica e todos os pacientes com estréia de cirrose hepática relacionada ao álcool durante a admissão, independentemente do motivo da admissão, são elegíveis para inclusão.

Este estudo não compromete o diagnóstico ou o tratamento de cirrose ou comorbidades, e a inclusão em estudos intervencionistas durante o acompanhamento prospectivo é possível.

Recrutamento Todos os pacientes com estréia na cirrose hepática suspeitos de estar relacionados ao uso de álcool e, independentemente do tempo e circunstâncias do diagnóstico, comorbidades e gravidade da doença, receberão inclusão na coorte. Todos os participantes serão contratados pelo médico ou pelo enfermeiro, prestando padrão de atendimento. Todos os participantes serão informados por escrito e oralmente por investigadores de estudo e enfermeiros do projeto.

Intervenção de cessação do álcool e padrão de atendimento Todos os pacientes com ALC tratados na unidade gastronômica, AHH, e, portanto, todos os participantes deste estudo receberão o padrão de tratamento de cuidados. Isso inclui investigações com bioquímica padrão, ultrassom, fibroscana, tomografia computadorizada e endoscopia, além de suplementos nutricionais, tratamento médico para cirrose e complicações e comorbidades.

A intervenção de cessação do álcool será oferecida como padrão de tratamento de cuidados a todos os pacientes com ALC. A intervenção inclui tratamento médico de sintomas de abstinência e desejo e apoio ao encaminhamento para ofertas municipais de tratamento com álcool. Além disso, com o objetivo de facilitar a cessação de álcool e apoiar o tratamento adicional sobre álcool no setor primário, os pacientes receberão entrevista motivacional (IM) como parte de seu tratamento.

Os pacientes e possíveis cuidadores serão convidados para três sessões de MI, realizadas por enfermeiros especializados na clínica hepática nos primeiros três meses após o diagnóstico.

Dados de periódicos de pacientes neste estudo, recuperaremos informações do diário do paciente após o consentimento por escrito.

Os dados recuperados dos periódicos dos pacientes antes de obter o consentimento são limitados ao diagnóstico de ALC, tempo do diagnóstico e causa de admissão ou indicação hospitalar que levaram ao diagnóstico de ARLD. Os dados biométricos obtidos antes do consentimento por escrito à participação não serão recuperados para o estudo. Esses dados podem ser coletados de um período de zero a trinta dias antes da inclusão e serão repassados ​​aos investigadores do clínico e do pessoal de estudo.

Os dados e informações pessoais são registrados e monitorados após a legislação atual, a Lei de Proteção de Dados e, conforme declarado pelo regulamento geral de proteção de dados.

Análises genéticas O DNA será extraído das células sanguíneas, sangue total e de fezes dos participantes. O DNA será armazenado em -80 ° C até uma análise posterior. A genotipagem será realizada com um chip GWAS (ou seja, mapeamento genômico direcionado) usando o Illumina Exomechip enriquecido para variantes de grande efeito de mudança de proteínas. As variantes Ultra-Rare (<1/1000) não serão capturadas. Os resultados de análises genéticas combinadas com dados clínicos podem identificar genes associados à mortalidade, sobrevivência e gravidade da doença em um contexto de 'perfil de risco'. A análise genômica compreende variantes comuns e perfil de pontuação de risco poligênico em variantes comuns. O sequenciamento de genoma inteiro não será realizado.

As análises genéticas no DNA bacteriano das fezes serão usadas para análises comparativas da interação entre disfunção intestinal e cirrose hepática.

Transcriptômica, metabolômica e proteômica para identificação de novos marcadores potenciais envolvidos no desenvolvimento, progressão e remissão de ALC, transcriptômica, metabolômica e proteômica serão realizados no tecido hepático e no sangue. As análises avaliarão os níveis de expressão e a localização celular de possíveis biomarcadores, incluindo receptor e ligantes, bem como moléculas de sinalização a jusante. As técnicas aplicadas são descritas abaixo. Juntamente com os dados clínicos, os resultados melhorarão a compreensão de possíveis fatores de remissão e progressão do ARLD.

O campo das tenchnologias ômicas de descoberta está em rápida evolução, e os métodos podem estar sujeitos a adaptações à qualidade, relevância e os melhores prêmios para a análise.

A análise proteômica da análise de amostras de plasma garante uma alta taxa de sucesso e a amostragem repetida ao longo do tempo é facilmente tolerada pelos pacientes. As biópsias hepáticas congeladas serão coletadas na linha de base e aos 12 meses para análise. A preparação de amostras e análise de cromatografia líquida e espectrometria de massa (LC/MS) seguirá as tecnologias descritas anteriormente na Torben Hansen e no Centro de Pesquisa Metabólica Básica (CBMR), Universidade de Copenhague. Na análise de proteoma plasmático de tiro único, a mistura peptídica é eluída evosep um sistema LC (Evosep Biosystems) acoplado on-line a um espectrômetro de massa Orbitrap Exploris 480.

Análises lipidômicas:

A análise é realizada de acordo com os procedimentos existentes de ponta e modificada para aplicar a melhor tecnologia disponível.

After plasma preparation, chromatographic separation is performed on Waters Acquity BEH C18 column (1.7μm X 2.1mm X 100 mm) using the gradient of two standard mobile phases (mobile phase A contains water, 0.1% formic acid and 10 ml 1M ammonium acetate, mobile phase B composes isopropanol and acetonitrile (1:1) with the same addition of formic acid and ammonium acetate).

A identificação de espectrometria de massa de compostos é direcionada com base em uma biblioteca pré-fabricada de metabólitos alvo no plasma.

Com base nos resultados das análises lipidômicas, selecionaremos um painel de marcadores de diagnóstico, que descreverá com mais eficiência a velocidade da progressão da doença. Para os biomarcadores selecionados, desenvolveremos um método quantitativo absoluto, baseado na metodologia LC-MS-MS (Triple Quadrupolo MS no modo MRM), usando compostos padrão disponíveis comercialmente, incluindo compostos estáveis ​​marcados com isótopos como padrões internos. O método será validado de acordo com protocolos padronizados. No caso de resultados bem-sucedidos, seremos capazes de definir limites de concentração dos biomarcadores de painéis para a previsão de progressão lenta, média e rápida, bem como a longo prazo, tornando o método pronto para transferir para laboratórios clínicos e medicamentos personalizados.

A análise biológica e o gerenciamento de dados da proteômica e lipidômica ocorrerão no CBMR.

Análises de análise transcriptomômica e bioestatística serão realizadas no Centro de Pesquisa Metabólica Básica.

O sequenciamento de RNA a granel fornece um cenário de transcrição em todo o tecido e permite uma investigação profunda no transcriptoma, mas não distingue entre células individuais. Para identificar genes que desempenham um papel importante na progressão ou recompensação da AH, compararemos os conjuntos de dados do sequenciamento de RNA a granel em AH com conjuntos de dados já estabelecidos do sequenciamento de RNS de células únicas do fígado.

Com base em genes que são sugeridos simultaneamente pelo RNA em massa em nossas amostras e scrnaseq, podemos explorar os principais reguladores transcricionais da ALC.

Usaremos esse recurso para desconvoluzir computacionalmente os dados do transcriptoma em massa das biópsias hepáticas para estimar a abundância relativa de cada tipo de célula do fígado (hepatócitos, células estreladas hepáticas, células epiteliais sinusoidais hepáticas, etc.) em cada paciente. Possíveis reguladores de doenças de progressão e recompensação serão avaliados.

Pesquisa BioBank Um biobank será estabelecido para o estudo. O biobank conterá sangue coletado na linha de base, três meses, 1 e 3 anos, e o tecido hepático e as fezes coletadas na linha de base e após 1 ano. Em cada momento, 15 ml de sangue e 3 grama de fezes são coletados. Na linha de base e após 1 ano 0,2 grama de tecido hepático será coletado. Se um participante tiver ascite e precisar de paracentese, uma biópsia de gordura subcutânea será retirada do ponto de incisão no abdômen.

O material excedente do estudo será transferido para um biobank para pesquisas futuras.

Perspectivas O estudo contribuirá para uma melhor caracterização de doenças hepáticas avançadas relacionadas ao álcool e contribuirá para uma melhor organização futura de ofertas de tratamento e reabilitação a pacientes com doença hepática. A caracterização completa e a inclusão consecutiva aumentarão nosso entendimento sobre a incidência, prevalência e impacto da ALC na população, bem como a utilização de recursos de assistência médica alocados ao seu tratamento.

Uma visão mais profunda dos mecanismos moleculares de progressão e remissão hepática, em combinação com dados clínicos, apoiará nossa capacidade de prever resultados na cirrose, facilitará o monitoramento personalizado, com o objetivo de fornecer o tratamento certo para o paciente certo no momento certo.

O estudo de coorte prospectivo contribuirá ainda mais para a identificação de fatores de risco anteriormente não identificados significativos para a sobrevivência e o uso de serviços de saúde; e, assim, formam a base da implementação de mudanças nas práticas de saúde que oferecem benefícios econômicos e médicos. Além disso, o estudo pode descobrir novas áreas para pesquisas intervencionistas com pontos de extremidade clinicamente relevantes.