Optimeret remission i alkoholrelateret levercirrhose (Pro-ALC)

I Danmark øges forekomsten af ​​levercirrhose fem gange for mænd og tredoblet for kvinder i de sidste fyrre år. I 2008 blev ca. 15.000 mennesker diagnosticeret med levercirrhose. Patienter, der er tilbagetaget på hospitalet, har en højere 90-dages dødelighed end dem, der undgår tilbagetagelse.

Det kliniske forløb af levercirrhose inkluderer komplikationer af ascites, leverencephalopati, variceal blødning, nyredysfunktion og infektioner med gentagne indlæggelser på hospitalet, der markant forværrer prognosen. Disse komplikationer er drevet af udviklingen af ​​portalhypertension i leveren. Denne progression til det 'dekompenserede' trin betragtes som et kendetegn i sygdomsforløbet, da dekompensationen er forbundet med en markant øget risiko for yderligere komplikationer og død.

Flere kliniske undersøgelser har forsøgt at finde medicinske retsmidler, der forhindrer komplikationer relateret til portalhypertension eller bremser yderligere progression i cirrhose. Alligevel indikerer stigende bevis for, at aktive målinger af behandling af den underliggende årsag til leversygdom og fjernelse af de giftige midler, der forårsager cirrhose, kan bremse sygdomsprogression eller endda fremkalde regression af cirrhose. Dette koncept beskrives som leverudvikling.

Kliniske og biokemiske træk såsom BMI og albuminniveauer kan være knyttet til genkompensation, men der er et markant behov for kliniske studier, der undersøger nye biomarkører med evnen til at forudsige og overvåge forbedring i levercirrhose, med og uden virkningen af ​​alkohol.

Mellem 75% og 80% af patienterne med levercirrhose i Danmark har eller har haft en skadelig brug af alkohol. Afhængighed af alkohol fører til social isolering, risiko for arbejdsløshed og en nedsat overholdelse af sundhedsvæsenet (8). Cirrhose er relateret til nedsat livskvalitet og påvirker patienter og pårørende både følelsesmæssige og socioøkonomisk.

Alkoholrelateret leversygdom (ARLD) har en stor indflydelse på patienternes sundhed og liv, og behandling drejer sig om symptomatisk lindring og forebyggelse af yderligere komplikationer. Der er et uopfyldt behov for at undersøge behandlingsmuligheder, der ikke kun lindrer komplikationer, men også adresserer de underliggende veje for alkoholrelateret leversygdom, også i alvorlige stadier af alkoholrelateret cirrhose (ALC). Tidligere undersøgelser, der undersøger genkompensation i ARLD, er retrospektive og ikke designet til det nøjagtige formål.

Faktorer som BMI, kvindeligt køn og mindre portalhypertension vides at være forbundet med en øget sandsynlighed for genkompensation. Yderligere faktorer for genetisk aktivering og molekylærbiomarkører fra proteomet og lipidomet har kun tiltrukket mindre opmærksomhed, og virkningen af ​​behandling af driverne for dekompensation, portalhypertension og alkoholbrug og deres indflydelse på den naturlige årsag til sygdom er ikke blevet behandlet.

Gastro-enheden, Amager-HVidovre Hospital (AHH) har et rekordområde på 550.000 borgere syd og vest for København. Gastro -enheden er den største i Danmark med app. 90 optagelser dagligt. 140 personer diagnosticeres med levercirrhose årligt i vores afdeling, enten ved henvisning fra almen praksis eller ved debut af sygdom under hospitalets optagelse. Fra november 2019 til marts 2022 blev 357 patienter evalueret for levercirrhose i gastro -enheden. 20 % af disse døde inden for tolv måneder. 75% havde alkoholbrug som den primære årsag til levercirrhose.

Nye molekylære teknologier og risikoforudsigelse Molekylær patofysiologi af ARLD forstås ufuldstændigt. Karakterisering af proteomdynamikken på tværs af spektret af ALD kunne give ny indsigt i sygdomsmekanismer for både progression og remission af sygdom. De seneste fremskridt inden for MS-baseret proteomik har i høj grad udvidet sin indflydelse i biomedicinsk og klinisk forskning. Det muliggør identifikation og kvantificering af tusinder af proteiner, hvilket gør det velegnet til at studere sygdomsmekanismer og identifikation af biomarkører. Tidligere undersøgelser har vurderet proteomet i metabolisk dysfunktion-associeret steatotisk leversygdom (MASH) og alkoholrelateret fibrose, og proteomiske profiler viste en stærk tilknytning til sværhedsgraden af ​​leversygdom. Undersøgelser med på hinanden følgende opfølgning i de alvorlige stadier af ALC mangler stadig.

MS-baseret proteomik kan identificere biomarkører for forudsigelig værdi i klinikken, især i udsigten til remission af sygdom. Kobling til kliniske data og resultater kan understøtte brugen af ​​proteomiske biomarkører i forudsigelse og overvågning af remission i AH og genkompensation i ALC.

Flere markører for betændelse og cytokiner er involveret i at drive dekompensation og har potentialet til at forudsige risikoen for tidlig død. Det er ukendt, om sådanne markører kan forudsige remission og genkompensation i ALC og AH. Tidligere undersøgelser har vurderet forholdet mellem betændelse og dødelighed, men prospektive undersøgelser, der undersøger sammenhængen mellem biomarkører for metabolisme og prognose, overvågning og effektivitet OG -behandling i ALC mangler.

Transkriptomik og genaktivering i progression og remission af leversygdom Molekylær og cellulær kompleksitet af levermikromiljøet er fortsat en vigtig hindring, der hindrer udviklingen af ​​potentielle behandlinger. Tidligere undersøgelser i RNA-sekventering er små og med opfølgning.

Med fremskridt inden for genchips og sekventering med høj kapacitet er der etableret adskillige prognostiske genunderskrifter for at forudsige den samlede overlevelse i levercirrhose.

Nylige enkeltcelle -RNA -sekventerings- og bulk -RNA -sekventeringsundersøgelser har vist, at specifikke mesenchymale, endoteliske og monocytlinjer beriges i cirrhotiske lever.

Hele væv (bulk) RNA -sekventering tilvejebringer en gennemsnitlig aflæsning af RNA -indholdet i en prøve, som repræsenterer blandede RNA -signaler fra de forskellige celler, der er til stede i vævet, og er således signifikant påvirket af celletypeudbredelse. Sammenlignet med enkeltcelle-RNA-sekventering (SCRNA-seq) kan bulk-RNA-sekventering ikke bruges til at undersøge sjældne cellepopulationer eller specifikke patogene cellesubpopulationer, men det giver indsigt i mønstre af patogen gentranskription og cellulær dysfunktion, især når den er knyttet til klinisk fænotype og sammenlignet med et SCRNA-seq-bibliotek med levervæv.

Ingen undersøgelser har tidligere sammenlignet ændringer i transkriptomet efter fjernelse af de giftige midler, der forårsager leverskade.

I ALC er der et uopfyldt behov for at undersøge behandlingsmuligheder, der adresserer de underliggende veje for ARLD, også i svære stadier af cirrhose. Induktion af genkompensation vil forlænge både overlevelse og 'optagelsesfri' dagligdag for patienter med ALC.

Mål Det overordnede mål med den nuværende undersøgelse er at undersøge den molekylære profil og veje hos personer med ALD for at understøtte personlig overvågning og opfølgning i levercirrhose.

Hypotese Prognosen for ALC varierer afhængigt af kontinuerlig eller ophørt alkoholindtagelse. Alkohol kan påvirke overlevelse og nedkompensation i ALC. Alkohol kan påvirke den molekylære profil for hver person med ALC og dermed påvirke indlæggelser på hospitalet, tilbagetagelser og progression af levercirrhose.

Bedre viden om den molekylære profil af personer med ALC vil i kombination med kliniske træk ved patientens sundhed og fysiske ydeevne gøre det muligt for os at planlægge og administrere handlinger med personlig behandling, overvågning og opfølgning af mennesker med ALC.

En dybere indsigt i de molekylære mekanismer for leverdrivende progression og remission af cirrhose vil-i kombination med klinisk data-understøtter vores evne til at forudsige resultater i cirrhose, lette personlig overvågning og opfølgning og understøtte den rigtige og rettidige behandling af den rigtige patient. Resultaterne kan også understøtte udviklingen af ​​nye molekylære lægemiddelmål til behandling og forebyggelse af cirrhose i fremtiden.

Metoder Undersøgelsen er en forekomst -kohort, hvor patienter vil blive fulgt af diagnose til død eller tilbagetrækning fra kohorten. Vi vil forsøge at inkludere patienter på hinanden følgende inden for tre måneder efter diagnosen. Resultaterne rapporteres efter STROBE -retningslinjer.

Undersøgelsespersoner alle personer med en indledende henvisning til undersøgelse for og diagnose af alkoholrelateret levercirrhose i gastro-enheden, og alle patienter med en debut af alkoholrelateret levercirrhose under indlæggelse uanset årsagen til optagelse er berettigede til inkludering.

Denne undersøgelse kompromitterer ikke diagnostik eller behandling af cirrhose eller komorbiditeter, og inkludering i interventionsundersøgelser under den potentielle opfølgning er mulig.

Rekruttering Alle patienter med en debut af levercirrhose, der mistænkes for at være relateret til brug af alkohol, og uanset tid og omstændigheder ved diagnose, vil komorbiditeter og sværhedsgrad af sygdom blive tilbudt inkludering i kohorten. Alle deltagere vil blive engageret af enten lægen eller sygeplejersken, der leverer plejestandard. Alle deltagere vil blive informeret skriftligt såvel som mundtligt af undersøgelsesundersøgere og projektsygeplejersker.

Intervention af alkohol ophør og standard for pleje Alle patienter med ALC behandlet i gastroenheden, AHH, og derfor vil alle deltagere i denne undersøgelse blive tilbudt standarden for plejebehandling. Dette inkluderer undersøgelser med standard biokemi, ultralyd, fibroscan, CT-scanning og endoskopi samt ernæringstilskud, medicinsk behandling til cirrose og komplikationer og komorbiditeter.

Interventionen med alkoholophæng vil blive tilbudt som standard for plejebehandling til alle patienter med ALC. Interventionen inkluderer medicinsk behandling af abstinenssymptomer og trang og støtte til henvisning til kommunale tilbud om alkoholbehandling. Med det formål at lette alkoholopfattelse og støtte yderligere alkoholbehandling i den primære sektor vil patienterne blive tilbudt motiverende interview (MI) som en del af deres behandling.

Patienterne og mulige plejere vil blive inviteret til tre MI -sessioner udført af specialiserede sygeplejersker i leverklinikken inden for de første tre måneder efter diagnosen.

Data fra patientjournal i denne undersøgelse vil vi hente oplysninger fra Patient Journal efter skriftligt samtykke.

Data hentet fra patienttidsskrifter inden opnåelse af samtykke er begrænset til diagnose af ALC, diagnosen tid og årsagen til hospitaloptagelse eller henvisning, der førte til diagnose af ARLD. Biometriske data opnået før skriftligt samtykke til deltagelse vil ikke blive hentet til undersøgelsen. Disse data kan indsamles fra en periode på nul til tredive dage før optagelse og videregives til klinikernes efterforskere og studerer personale.

Data og personlige oplysninger registreres og overvåges efter den nuværende lovgivning, databeskyttelsesloven og som anført ved den generelle databeskyttelsesforordning.

Genetiske analyser DNA ekstraheres fra blodlegemer, helblod og fra afføring fra deltagerne. DNA'et gemmes ved -80C, indtil yderligere analyse. Genotyping udføres med en GWAS-chip (dvs. Målrettet genomisk kortlægning) ved anvendelse af Illumina ExomeChip beriget til proteinskiftende varianter af storeffekt. Ultra-sjældent varianter (<1/1000) vil ikke blive fanget. Resultater fra genetiske analyser kombineret med kliniske data kan identificere gener, der er forbundet med dødelighed, overlevelse og sværhedsgrad af sygdommen i en 'risikoprofilering' -kontekst. Genomisk analyse omfatter almindelige varianter og profilering af polygen risikoscore på almindelige varianter. Hele genomsekventering udføres ikke.

Genetiske analyser på bakterie -DNA fra afføring vil blive anvendt til sammenlignende analyser af samspillet mellem tarmdysfunktion og levercirrhose.

Transkriptomik, metabolomik og proteomik til identifikation af nye potentielle markører involveret i udvikling, progression og remission af ALC, transkriptomik, metabolomik og proteomik vil blive udført på levervæv og blod. Analyser vil evaluere ekspressionsniveauer og cellulær lokalisering af mulige biomarkører, herunder receptor og ligander samt nedstrøms signalmolekyler. De anvendte teknikker er beskrevet nedenfor. Sammen med kliniske data vil resultaterne forbedre forståelsen af ​​mulige drivere til remission og progression af ARLD.

Feltet med opdagelsesomics -tenchnologier udvikler sig hurtigt, og metoder kan være underlagt tilpasninger til at sikre kvalitet, relevans og de bedste præmier til analysen.

Proteomisk analyseanalyse af plasmaprøver sikrer en høj succesrate, og gentagen prøveudtagning over tid tolereres let af patienter. Snap-frosne leverbiopsier indsamles ved baseline og efter 12 måneder til analyse. Fremstilling af prøver og væskekromatografi og massespektrometri (LC/MS) -analyse vil følge teknologier, der tidligere er beskrevet fra Torben Hansen og Center for Basic Metabolic Research (CBMR), Copenhagen University. I en enkelt-shot plasmaproteomanalyse elueres peptidblandingen EVOSEP One LC-system (EVOSEP Biosystems) koblet online til en Orbitrap Exploris 480 massespektrometer.

Lipidomikanalyser:

Analyse udføres i henhold til avancerede eksisterende procedurer og ændres for at anvende den bedste tilgængelige teknologi.

Efter plasmaforberedelse udføres kromatografisk adskillelse på Waters Acurity BeH C18 -søjle (1,7 μm x 2,1 mm x 100 mm) ved anvendelse af gradienten af ​​to standard mobile faser (mobil fase A indeholder vand, 0,1% myresyre og 10 ml 1 m ammoniumacetat, mobil fase B komponerer isopropanol og acetonitrile (1: 1) med den samme tilsætning af formisk syre Acetate.

Massespektrometri-identifikation af forbindelser er målrettet baseret på et foruddannet bibliotek med målmetabolitter i plasma.

Baseret på resultaterne fra lipidomics -analyserne vælger vi et panel af diagnostiske markører, som mest effektivt vil beskrive hastigheden af ​​sygdomsprogressionen. For de valgte biomarkører vil vi udvikle en absolut kvantitativ metode, der er baseret på LC-MS-MS (Triple Quadrupole MS i MRM-tilstand) metodologi ved anvendelse af kommercielt tilgængelige standardforbindelser, herunder stabile isotopmærkede forbindelser som interne standarder. Metoden valideres i henhold til standardiserede protokoller. I tilfælde af vellykkede resultater vil vi være i stand til at indstille koncentrationsgrænser for panelbiomarkører til forudsigelse af langsom, mellemstor og hurtig sygdomsprogression, såvel som på lang sigt gør metoden klar til at overføre til kliniske laboratorier og personlig medicin.

Den biologiske analyse og datastyring af proteomik og lipidomik finder sted på CBMR.

Transkriptomomikanalyser Analyser og biostatistik vil blive udført i Center for Basic Metabolic Research.

Bulk-RNA-sekventering tilvejebringer et vævsdækkende transkriptionslandskab og giver mulighed for dyb undersøgelse af transkriptomet, men det skelner ikke mellem individuelle celler. For at identificere gener, der spiller en vigtig rolle i progressionen eller genkompenseringen af ​​AH, vil vi sammenligne datasæt fra bulk -RNA -sekventering i AH til allerede etablerede datasæt fra enkeltcelle RNS -sekventering af leveren.

Baseret på gener, der samtidig foreslås af bulk-RNA i vores prøver og scrnaseq, kan vi udforske de vigtigste transkriptionelle regulatorer i ALC.

Vi vil bruge denne ressource til beregningsmæssigt at dekonvolute bulk -transkriptomdataene fra leverbiopsierne for at estimere den relative forekomst af hver celletype af leveren (hepatocyt, lever -stellatceller, lever sinusformede epitelceller osv.) Hos hver patient. Mulige sygdomsregulatorer af både progression og genkompensation vil blive vurderet.

Forskning Biobank En Biobank etableres til undersøgelsen. Biobanken vil indeholde blod indsamlet ved baseline, tre måneder, 1 og 3 år og levervæv og afføring opsamlet ved baseline og efter 1 år. På hvert tidspunkt indsamles 15 ml blod og 3 gram afføring. Ved baseline og efter 1 år opsamles 0,2 gram levervæv. Hvis en deltager har ascites og har brug for paracentese, vil en subkutan fedtbiopsi blive taget fra snitpladsen på maven.

Overskudsmateriale fra undersøgelsen overføres til en biobank til fremtidig forskning.

Perspektiver Undersøgelsen vil bidrage til en bedre karakterisering af avanceret leversygdom relateret til alkohol og bidrage til en forbedret fremtidig organisering af behandlings- og rehabiliteringstilbud til patienter med leversygdom. Grundig karakterisering og sammenhængende inkludering vil øge vores forståelse af forekomsten, udbredelsen og virkningen af ​​ALC i befolkningen samt udnyttelsen af ​​sundhedsvæsenets ressourcer, der er tildelt dens behandling.

En dybere indsigt i de molekylære mekanismer for leverprogression og remission vil i kombination med kliniske data understøtte vores evne til at forudsige resultater i cirrhose, lette personlig overvågning, der sigter mod at tilvejebringe den rigtige behandling for den rigtige patient på det rigtige tidspunkt.

Den potentielle kohortundersøgelse vil yderligere bidrage til identifikationen af ​​tidligere uidentificerede risikofaktorer, der er signifikante for overlevelse og brugen af ​​sundhedsydelser; og danner derved grundlaget for implementering af ændringer i sundhedspraksis, der tilbyder både økonomiske og medicinske fordele. Derudover kan undersøgelsen afsløre nye områder til interventionsforskning med klinisk relevante slutpunkter.