乳腺癌患者的 Onco4D(TM) 生物动力化疗选择

研究理由：MCT 准确评估肿瘤异种移植物的能力可能使其成为一种可靠的技术，用于根据对治疗的预测反应对患者进行肿瘤分层，从而可以根据个体患者的个人需求进行治疗选择。 本研究旨在评估 MCT 作为预测化疗药物对乳腺癌新辅助治疗和辅助治疗中常规使用的化疗药物的化疗敏感性的一种检测方法。 如果结果呈阳性，则该研究的结果将为扩大临床试验和使用 MCT 进行治疗选择提供依据。

背景：活细胞成像已成为高内涵分析和药物发现应用的标准。 最常见的活细胞检测包括活力、增殖和细胞毒性检测，因为细胞生理学和功能是根据异生素的应用扰动来测量的。 细胞和组织活力测定通常使用外源性活性染料作为膜完整性或细胞代谢活动的生物标志物进行测量。 然而，染料是侵入性的，具有潜在毒性，并且通常需要固定组织或透化膜 [1, 2]。 此外，高内涵分析和流式细胞术的通用格式需要分离的细胞，或分布在平坦硬表面上的细胞。 分离的细胞缺乏许多与生物学相关的细胞间连接和通讯，而这些是健康组织的标志 [3、4]，并且平板上的扁平细胞具有病理形状和各向异性细胞粘附 [5]。

发现可以预测对癌症治疗的反应的技术是当务之急。 虽然存在许多评估药物离体早期反应的技术，但在三维组织或培养物中进行生存力、细胞毒性和增殖测定的需求变得越来越紧迫 [6, 7]，因为 2D 中的药物反应通常不同作为生物相关三维培养中的药物反应。 这部分是因为单层培养物中没有保存基因组图谱 [8-10]。 已经有几项研究追踪了与细胞存活、增殖、分化和治疗抗性相关的基因的表达，这些基因在 2D 培养物中相对于三维培养物表达不同。 例如，在三维培养中测量时，上皮性卵巢癌 [11、12]、肝细胞癌 [13-15] 或结肠癌 [16] 的细胞系显示的表达谱更像来自肿瘤组织的表达谱，但在生长于2D。 此外，3D 培养的三维环境呈现出与 2D 单层培养不同的药代动力学，并在癌症药物敏感性方面产生差异 [17-20]。 最后，大多数当前技术依赖于破坏性的终点评估，阻碍了随着时间的推移对治疗反应进行有意义的纵向观察。

将药物反应分析迁移到第三和第四维度的主要挑战之一是找到一种方法从活组织内部深处（高达一毫米）提取重要信息。 组织是半透明的，光可以扩散传播许多厘米。 此外，活细胞的动态运动会引起动态光散射，从而在散射光场上产生相位波动，这可以作为来自组织的漫反射光中的动态散斑进行测量。 这是扩散波谱 (DWS) [21、22] 和扩散相关光谱 (DCS) [23-26] 的基础，但这些技术缺乏深度分辨率。 表征组织中光传播的一个强大工具是使用干涉测量法 [27]。 干涉检测是光学相干断层扫描 (OCT) [28-31] 的基础过程，这是一种抑制散斑的点扫描技术 [32-34]，尽管 OCT 数据中的散斑去相关可以提供与 DCS 提供的信息类似的信息。 这已被用于测量细胞内流变学 [35] 和发现细胞凋亡的动态特征 [36]。 也可以使用相差显微镜 [38] 在细胞分辨率下检测运输，但这种方法不能用于厚组织。

Nolte 博士及其同事开发了体积分辨组织动态成像，该成像利用了低相干干涉测量法的深度选择性优势，并结合了广域照明数字全息术中的高散斑对比度。 该技术称为运动对比断层扫描 (MCT)，使用低相干数字全息术穿透活组织 1 毫米，以测量活细胞动态运动产生的光散射的散斑动力学 [37]。 它以前被用作细胞毒性测定来研究抗有丝分裂药物的功效 [40]。 从本质上讲，该技术通过分析细胞器的“运动”来发挥作用。 细胞器运动的特定变化在接受化疗治疗反应的细胞中很早就可以检测到，并且可以用作化疗反应的早期预测指标。

MCT 基于光学相干成像 (OCI) [38]。 OCI 是一种收集反向散射散斑的全场短相干全息术 [39]。 在相干门控的帮助下，OCI 可以对深度达 1 毫米的组织进行光学切片。 MCT 特别使用细胞内运动作为内源性对比来表征三维活组织内的亚微米亚细胞运动 [42]。

图1显示了MCT的全息记录原理。 校准后，短相干光首先被分成物光束和参考光束。 物体光束撞击活体组织样本，来自组织的反向散射散斑被透镜 L1 收集。 活组织样本位于透镜 L1 的焦平面上，因此 L1 还对反向散射光进行光学傅立叶变换。 电荷耦合器件 (CCD) 位于 L1 的另一个焦平面，因此它捕获来自组织的傅里叶变换散射光。 参考光束由延迟级（图中未示出）控制以调整参考光束的路径长度以执行物体和参考光束之间的零路径匹配。 分束器将两个光束组合在一起，因为它们是零路径匹配的，所以它们在 CCD 平面上发生干涉。 参考光束在离轴配置中倾斜 20°，干涉条纹 (Λ) 的间距为 3 个像素 (24 μm)。 散斑大小 (aspec) 调整为 3 条纹宽 (70 μm)。 有关实验设置的更多详细信息，请参见参考文献 [41]。

图。1。 MCT对多细胞肿瘤球体的原理。 生物样本位于透镜 L1 的图像平面上。 来自样品的背向散射光经过 L1 傅里叶变换，并与 CCD 芯片上的参考光束发生干涉。 散斑全息图记录在傅里叶平面上，与参考光束的交叉角为 20°。 a) 原始数字全息图的示例​​； b) 重建图像； c) MCI 图像。 O.A.：光轴； I.P.：图像平面； L1：镜头； BS：分束器； CCD：电荷耦合器件。

离体癌症化学敏感性分析 MCT 以前曾用于研究使用多细胞肿瘤球体的抗有丝分裂药物的功效 [40]。 当将 MCT 应用于肿瘤异种移植物时，它还能够在顺铂下的两种细胞系之间显示出显着不同的反应。 用药后，铂类敏感细胞系（A2780）的归一化标准差（NSD）值在8小时内从0.7下降到0.1。 相比之下，铂类耐药细胞系 (A2780-CP70) 的 NSD 值在给药 9 小时后几乎保持恒定（0.81 至 0.80）。 与 A2780 相比，附着在肿瘤异种移植物上的正常小鼠组织的 NSD 值仅降低了一点点（0.6 至 0.52）。 图2显示了顺铂药物反应曲线。 每个点的 NSD 值在整个目标上取平均值。 A2780-CP70 和正常小鼠组织的测量间隔时间为 24 分钟，A2780 为 12 分钟。 在时间 t = 0 时应用 20 μM 顺铂，A2780-CP70 和正常小鼠组织的测量持续 9 小时，A2780 持续 8 小时。 在时间 = 0 时，侵袭性细胞系 A2780-CP70 具有最高的 NSD，而正常小鼠肠系膜组织具有最低的 NSD (0.6)。 铂敏感细胞系 A2780 的 NSD 位于中间：0.7。 应用顺铂后，A2780的NSD曲线立即下降。 A2780-CP70的NSD值几乎没有变化。

图 2 卵巢癌肿瘤异种移植物对 20 μM 顺铂有反应的运动性指标 (NSD)。 x 轴是时间（分钟），y 轴是 NSD 值。 敏感肿瘤为A2780，不敏感肿瘤为A2780-CP70。 两种肿瘤组织开始时都比正常小鼠组织具有更高的运动性。 在时间 t=0 时加入顺铂。 A2780 的 NSD 下降得非常快，8 小时后下降到 0.1。 不敏感肿瘤A2780-CP70的NSD在9小时周期内没有变化。 与A2780相比，正常小鼠组织的NSD略有下降。

在兽医临床环境的进一步研究中，MCT 已被用于预测犬非霍奇金淋巴瘤患者的预后。 犬非霍奇金淋巴瘤最初的特征是外周淋巴结的肿瘤浸润。 犬非霍奇金淋巴瘤的临床侵袭性和对化疗的反应各不相同。 目前唯一的化学反应性生物标志物是肿瘤细胞免疫表型（即 T 细胞与 B 细胞来源），但化学反应性在免疫表型中差异很大，这降低了该生物标志物的临床效用。 在我们的研究中，我们使用 MCT 来测量犬淋巴瘤活组织检查对标准护理多柔比星的异质性反应。 离体阿霉素反应性的生物动力学特征与犬类患者的结果相关。 这些研究首次证明了无标记细胞内生物动力学标记物在预测犬癌症治疗疗效方面的效用。

具体目标 主要研究目的是通过比较符合体外化疗反应或耐药性的 MCT 模式与通过反应评估测量的证实的化疗反应或耐药性，检查使用 MCT 作为接受新辅助化疗的乳腺癌患者的化学敏感性测定的可行性实体瘤标准 (RECIST) v1.1 标准。

主要终点：手术时测量的客观病理反应。