乳がん患者に対する Onco4D(TM) バイオダイナミック化学療法の選択

研究の理論的根拠：腫瘍異種移植片を正確に評価するMCTの実証済みの能力は、MCTを、治療に対する予測反応に基づく患者の腫瘍層別化のための信頼できる技術として確立する可能性があり、これにより個々の患者の個人的なニーズに基づいた治療選択が可能になる可能性がある。 この研究は、乳がんの術前および補助療法で日常的に使用される化学療法剤による治療に対する化学感受性を予測するためのアッセイとして MCT を評価するように設計されています。 陽性であれば、この研究の結果は臨床試験の拡大と治療法選択におけるMCTの使用の基礎を提供することになる。

背景: 生細胞イメージングは​​、ハイコンテンツ分析および創薬アプリケーションの標準となっています。 生細胞に対する最も一般的なアッセイには、生体異物の適用された摂動に応答して細胞の生理機能と機能が測定されるため、生存率、増殖、および細胞毒性アッセイが含まれます。 細胞および組織の生存率アッセイは、通常、膜の完全性または細胞の代謝活性のバイオマーカーとして外因性生体色素を使用して測定されます。 しかし、染料は侵襲的で潜在的に有毒であり、多くの場合、組織の固定または膜の透過処理が必要です [1、2]。 さらに、ハイコンテント分析およびフローサイトメトリーの一般的な形式では、単離された細胞、または平らな硬い表面に分散された細胞が必要です。 単離された細胞には、健康な組織の特徴である生物学的に関連した細胞間の接続やコミュニケーションの多くが欠けており[3、4]、プレート上の平らな細胞は病的な形状と異方性の細胞接着を持っています[5]。

がん治療に対する反応を予測できる技術の発見は緊急の優先事項です。 ex vivo での薬物に対する早期反応を評価する技術は数多く存在しますが、2D での薬物反応は同じではないことが多いため、3 次元組織または培養物での生存率、細胞毒性、および増殖アッセイを実行する必要性がますます緊急になっています [6, 7]。生物学的に関連した三次元培養における薬物反応として。 これは、ゲノムプロファイルが単層培養では保存されないことが部分的に原因です[8-10]。 細胞の生存、増殖、分化、および治療に対する耐性に関連する遺伝子の発現を追跡した研究がいくつかあり、これらの遺伝子の発現は、三次元培養と比較して二次元培養では異なって発現されます。 たとえば、上皮性卵巣癌 [11、12]、肝細胞癌 [13-15]、または結腸癌 [16] の細胞株は、三次元培養で測定すると腫瘍組織の発現プロファイルに似た発現プロファイルを示しますが、培養した場合はそうではありません。 2D。 さらに、3D 培養の三次元環境は、2D 単層培養とは異なる薬物動態を示し、抗がん剤感受性の違いを生み出します [17-20]。 最後に、現在のテクノロジーのほとんどは破壊的なエンドポイント評価に依存しており、長期にわたる治療反応の有意義な長期的観察を妨げています。

薬物反応アッセイを 3 次元および 4 次元に移行する際の主な課題の 1 つは、生体組織の深部 (最大 1 ミリメートル) から重要な情報を抽出する手段を見つけることでした。 組織は半透明で、光は数センチメートルまで拡散して伝播します。 さらに、生細胞の動的運動は動的光散乱を引き起こし、散乱光フィールド上に位相変動を生じさせ、組織からの拡散反射光の動的スペックルとして測定できます。 これは拡散波分光法 (DWS) [21、22] および拡散相関分光法 (DCS) [23-26] の基礎ですが、これらの技術には深さの分解能がありません。 組織内の光の伝播を特徴付ける強力なツールは、干渉法の使用です [27]。 干渉検出は、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) [28-31] の基礎となるプロセスであり、スペックルを抑制するポイントスキャン技術 [32-34] ですが、OCT データのスペックル無相関化により、DCS によって提供されるのと同様の情報が得られます。 これは、細胞内のレオロジー [35] を測定したり、アポトーシスの動的な兆候を見つけるために使用されています [36]。 位相差顕微鏡 [38] を使用して輸送を細胞分解能で検出することもできますが、このアプローチは厚い組織では使用できません。

Nolte 博士らは、低コヒーレンス干渉法による深さ選択性の利点と、広域照明デジタル ホログラフィーの高スペックル コントラストを組み合わせた、体積分解能の組織ダイナミック イメージングを開発しました。 この技術は運動性コントラスト断層撮影(MCT)と呼ばれ、低コヒーレンスデジタルホログラフィーを使用して生体組織に最大1ミリメートル浸透し、生体細胞の動的運動から散乱する光からスペックルダイナミクスを測定します[37]。 これは、抗有糸分裂薬の有効性を研究するための細胞毒性アッセイとして以前に適用されました [40]。 本質的に、この技術は細胞小器官の「動き」をプロファイリングすることによって機能します。 細胞小器官の動きの特定の変化は、化学療法治療に反応している細胞において非常に早い段階で検出可能であり、化学療法反応の早期予測因子として使用できる可能性があります。

MCT は光コヒーレンス イメージング (OCI) [38] に基づいています。 OCI は、後方散乱スペックルを収集するフルフィールドの短コヒーレンス ホログラフィー [39] です。 コヒーレンス ゲーティングの助けを借りて、OCI は最大 1 mm の深さまで組織を光学的に切断できます。 MCT は、特に細胞内運動を内因性コントラストとして使用して、三次元生体組織内のサブミクロンの細胞内運動を特徴付けます [42]。

図1にMCTのホログラフィック記録原理を示します。 校正後、短コヒーレンス光はまず物体光と参照光に分割されます。 物体ビームは生体組織サンプルに当たり、組織からの後方散乱スペックルがレンズ L1 によって収集されます。 生体組織サンプルはレンズ L1 の焦点面に位置するため、L1 は後方散乱光の光学フーリエ変換も実行します。 電荷結合素子 (CCD) は L1 のもう一方の焦点面に配置されているため、組織からのフーリエ変換された散乱光を捕捉します。 参照ビームは、遅延段（図示せず）によって制御され、参照ビームの経路長を調整して、物体ビームと参照ビームとの間のゼロ経路整合を実行する。 ビーム スプリッターは両方のビームを結合し、ゼロパス整合しているため、CCD 面で干渉します。 参照ビームは軸外構成で 20°傾けられ、干渉縞 (Λ) の間隔は 3 ピクセル (24 μm) です。 スペックル サイズ (aspec) は 3 縞幅 (70 μm) に調整されます。 実験セットアップの詳細については、参考文献 [41] を参照してください。

図1。 多細胞腫瘍スフェロイドに対する MCT の原理。 生体サンプルはレンズ L1 の像面に配置されます。 サンプルからの後方散乱光は L1 によってフーリエ変換され、CCD チップ上の参照光と干渉されます。 スペックル ホログラムは、参照光と 20°の交差角度でフーリエ面に記録されます。 例 a) 生のデジタル ホログラム。 b) 再構成された画像。 c) MCI画像。 O.A.: 光軸。 I.P.: イメージプレーン。 L1: レンズ。 BS: ビームスプリッター。 CCD: 電荷結合素子。

Ex vivo がん化学感受性分析 MCT は、以前、多細胞腫瘍スフェロイドを使用して抗有糸分裂薬の有効性を研究するために適用されました [40]。 MCT を腫瘍異種移植片に適用すると、シスプラチン下で 2 つの細胞株間で著しく異なる応答を示す可能性もあります。 薬剤の適用後、プラチナ感受性細胞株 (A2780) の正規化標準偏差 (NSD) 値は 8 時間で 0.7 から 0.1 に低下します。 対照的に、プラチナ耐性細胞株 (A2780-CP70) の NSD 値は、薬剤を適用してから 9 時間後もほぼ一定 (0.81 ～ 0.80) のままです。 腫瘍異種移植片に付着した正常なマウス組織の NSD 値は、A2780 と比較してわずか (0.6 ～ 0.52) しか減少しません。 図 2 は、シスプラチン薬物応答曲線を示しています。 各ポイントの NSD 値はターゲット全体で平均化されます。 測定間隔は、A2780-CP70 および正常マウス組織では 24 分、A2780 では 12 分です。 20 μM シスプラチンは時間 t = 0 で適用され、測定は A2780-CP70 および正常なマウス組織については 9 時間継続し、A2780 については 8 時間継続しました。 時間 = 0 では、攻撃的な細胞株 A2780-CP70 の NSD が最も高く、正常なマウス腸間膜組織の NSD は最も低くなります (0.6)。 プラチナ感受性細胞株 A2780 の NSD は中央にあります: 0.7。 シスプラチンを適用すると、A2780 の NSD 曲線はすぐに低下します。 A2780-CP70のNSD値はほとんど変わりません。

図 2 20 μM シスプラチンに反応する卵巣癌腫瘍異種移植片の運動性測定基準 (NSD)。 X 軸は時間 (分)、Y 軸は NSD 値です。 感受性の高い腫瘍は A2780 ですが、非感受性の腫瘍は A2780-CP70 です。 どちらの腫瘍組織も、正常なマウス組織よりも高い運動性で始まります。 シスプラチンは時間ｔ＝０で添加された。 A2780 の NSD は非常に急速に低下し、8 時間後には 0.1 まで低下しました。 非感受性腫瘍 A2780-CP70 の NSD は、9 時間の期間中変化しませんでした。 正常マウス組織の NSD は、A2780 と比較してわずかに低下しました。

獣医学の臨床現場でのさらなる研究では、犬の非ホジキンリンパ腫の患者転帰を予測するために MCT が使用されています。 イヌの非ホジキンリンパ腫は、最初は末梢リンパ節への腫瘍浸潤を特徴とします。 犬の非ホジキンリンパ腫は、臨床的な攻撃性と化学療法に対する反応が多様です。 化学反応性を示す現在の唯一のバイオマーカーは、腫瘍細胞の免疫表現型（つまり、腫瘍細胞の免疫表現型）です。 しかし、化学反応性は免疫表現型内で大きく異なるため、このバイオマーカーの臨床的有用性は低下します。 私たちの研究では、MCTを使用して、標準治療のドキソルビシンに対する犬リンパ腫生検の不均一な反応を測定しました。 ex vivo でのドキソルビシン応答性の生物力学的な特徴は、犬の患者の転帰と相関していました。 これらの研究は、イヌの癌治療の治療効果を予測するための標識フリーの細胞内生体力学マーカーの有用性を初めて実証した。

具体的な目的 研究の主な目的は、生体外での化学療法反応または抵抗性と一致する MCT パターンを、反応評価によって測定された化学療法に対する確認された反応または抵抗性と比較することにより、術前化学療法を受けている乳がん患者における化学療法感受性アッセイとして MCT を使用する実現可能性を調べることです。固形腫瘍の基準 (RECIST) v1.1 基準。

主要エンドポイント: 手術時に測定される客観的な病理学的反応。