Onco4D(TM) biodynamisk kemoterapiudvalg til brystkræftpatienter

UNDERSØGELSESRATIONALE: MCT's påviste evne til nøjagtigt at vurdere tumorxenotransplantater kan etablere det som en pålidelig teknik til patienttumorstratificering baseret på forudsagt respons på terapi, hvilket kunne muliggøre et behandlingsvalg baseret på den enkelte patients personlige behov. Denne undersøgelse er designet til at vurdere MCT som et assay til at forudsige kemofølsomhed over for behandling med kemoterapimidler, der rutinemæssigt anvendes i neoadjuverende og adjuverende behandling af brystkræft. Hvis de er positive, vil resultaterne af denne undersøgelse danne grundlag for udvidede kliniske forsøg og brug af MCT i terapivalg.

BAGGRUND: Billeddannelse af levende celler er blevet standarden for applikationer med højt indholdsanalyse og lægemiddelopdagelse. De mest almindelige assays på levende celler inkluderer levedygtigheds-, proliferations- og cytotoksicitetsassays, da cellulær fysiologi og funktion måles som respons på påførte forstyrrelser af xenobiotika. Cellulære og vævs levedygtighedsassays måles typisk ved hjælp af eksogene vitale farvestoffer som biomarkører for membranintegritet eller cellulær metabolisk aktivitet. Farvestoffer er dog invasive, potentielt giftige og kræver ofte fiksering af vævet eller permeabilisering af membranerne [1, 2]. Desuden kræver det almindelige format med højt indholdsanalyse og flowcytometri isolerede celler eller celler fordelt på flade hårde overflader. Isolerede celler mangler mange af de biologisk relevante intercellulære forbindelser og kommunikationer, der er kendetegnende for sundt væv [3, 4], og fladtrykte celler på plader har patologiske former og anisotrope cellulære adhæsioner [5].

Opdagelse af teknologi, der kan forudsige respons på kræftbehandling, er en presserende prioritet. Mens der eksisterer mange teknologier til at evaluere tidlig respons på lægemidler ex vivo, er behovet for at udføre levedygtighed, cytotoksicitet og proliferationsassays i tredimensionelt væv eller kultur blevet stadig mere presserende [6, 7], da lægemiddelrespons i 2D ofte ikke er det samme som lægemiddelrespons i biologisk relevant tredimensionel kultur. Dette skyldes til dels, at genomiske profiler ikke bevares i monolagskulturer [8-10]. Der har været flere undersøgelser, der har sporet ekspressionen af ​​gener forbundet med celleoverlevelse, proliferation, differentiering og resistens over for terapi, som udtrykkes anderledes i 2D-kulturer i forhold til tredimensionel kultur. For eksempel viser cellelinjer af epitelial ovariecancer [11, 12], hepatocellulært carcinom [13-15] eller tyktarmskræft [16] ekspressionsprofiler mere som dem fra tumorvæv, når de måles i tredimensionel kultur, men ikke når de dyrkes i 2D. Derudover præsenterer det tredimensionelle miljø af 3D-kultur en anden farmakokinetik end 2D-monolagskultur og producerer forskelle i kræftlægemiddelfølsomhed [17-20]. Endelig er de fleste nuværende teknologier afhængige af destruktiv slutpunktsvurdering, hvilket forhindrer meningsfuld longitudinel observation af terapirespons over tid.

En af hovedudfordringerne ved at migrere lægemiddelresponsanalyser til den tredje og fjerde dimension har været at finde et middel til at udtrække vital information fra dybt (op til en millimeter) inde i levende væv. Væv er gennemskinnelig, og lys kan forplante sig diffust mange centimeter. Ydermere forårsager levende cellers dynamiske bevægelser dynamisk lysspredning, der frembringer faseudsving på de spredte lysfelter, der kan måles som dynamisk pletter i diffust reflekteret lys fra væv. Dette er grundlaget for diffusionsbølgespektroskopi (DWS) [21, 22] og diffusionskorrelationsspektroskopi (DCS) [23-26], men disse teknikker mangler dybdeopløsning. Et stærkt værktøj til karakterisering af lysudbredelse i væv er brugen af ​​interferometri [27]. Interferometrisk detektion er den underliggende proces i optisk kohærenstomografi (OCT) [28-31], som er en punktscanningsteknik, der undertrykker pletter [32-34], selvom pletter-dekorrelation i OCT-data kan give lignende information som leveret af DCS. Dette er blevet brugt til at måle intracellulær rheologi [35] og til at finde dynamiske signaturer af apoptose [36]. Transport kan også påvises ved cellulær opløsning ved hjælp af fasekontrastmikroskopi [38], men denne tilgang kan ikke bruges i tykt væv.

Dr. Nolte og kolleger har udviklet volumetrisk opløst vævsdynamisk billeddannelse, der bruger fordelene ved dybdeselektivitet fra interferometri med lav kohærens, kombineret med høj pletterkontrast i digital holografi med bred belysning. Teknikken kaldes Motility Contrast Tomography (MCT) og bruger lavkohærens digital holografi til at trænge op til 1 millimeter ind i levende væv for at måle pletterdynamik fra lysspredning fra dynamisk bevægelse i levende celler [37]. Det blev tidligere anvendt som et cytotoksicitetsassay for at studere effektiviteten af ​​anti-mitotiske lægemidler [40]. I det væsentlige fungerer teknologien ved at profilere 'bevægelsen' af cellulære organeller. Specifikke ændringer i organellernes bevægelse kan påvises meget tidligt i celler, der gennemgår respons på kemoterapibehandling, og kan være anvendelige som en tidlig forudsigelse af kemoterapirespons.

MCT er baseret på optisk kohærensbilleddannelse (OCI) [38]. OCI er en kort-kohærens holografi i fuld felt [39], der samler tilbagespredte pletter. Ved hjælp af coherence gating kan OCI optisk snitte væv op til 1 mm dybt. MCT bruger specifikt intracellulær bevægelse som den endogene kontrast til at karakterisere submikron subcellulær bevægelse inde i tredimensionelt levende væv [42].

Figur 1 viser det holografiske optagelsesprincip for MCT. Efter kalibrering opdeles det korte kohærenslys først i en objektstråle og en referencestråle. Objektstrålen rammer den levende vævsprøve, og tilbagespredte pletter fra vævet opsamles af linsen L1. Den levende vævsprøve befinder sig i linsens L1's brændplan, så L1 udfører også en optisk Fourier-transformation af det tilbagespredte lys. Den ladningskoblede enhed (CCD) placeres i det andet brændplan af L1, så den fanger det Fourier-transformerede spredningslys fra vævet. Referencestrålen styres af et forsinkelsestrin (ikke vist på figuren) for at justere vejlængden af ​​referencestrålen for at udføre en nul-bane-match mellem objektet og referencestrålerne. Strålesplitteren kombinerer begge stråler, og fordi de er nul-vejs-matchede, interfererer de med CCD-planet. Referencestrålen vippes 20° i en konfiguration uden for aksen, og afstanden mellem interferenskanterne (Λ) er 3 pixels (24 μm). Plettet størrelse (aspec) er justeret til at være 3 frynser brede (70 μm). Yderligere detaljer om den eksperimentelle opsætning kan findes i reference [41].

Fig.1. Princippet om MCT på multicellulære tumorsfæroider. Den biologiske prøve er placeret ved billedplanet af linse L1. Det tilbagespredte lys fra prøven er Fourier-transformeret af L1 og interfereret med referencestrålen på CCD-chippen. Speckle-hologrammet er optaget på Fourier-planet med en 20 krydsende engel med referencestrålen. Eksempler på a) Rå digitalt hologram; b) rekonstrueret billede; c) MCI-billede. O.A.: optisk akse; I.P.: billedplan; L1: linse; BS: stråledeler; CCD: ladekoblet enhed.

EX VIVO CANCER KEMOSENSITIVITET ANALYSE MCT blev tidligere anvendt til at studere effektiviteten af ​​anti-mitotiske lægemidler ved hjælp af multicellulære tumorsfæroider [40]. Når MCT påføres på tumorxenografter, er det også i stand til at vise et signifikant forskelligt respons mellem to cellelinjer under cisplatin. Efter påføring af lægemidlet falder den normaliserede standardafvigelsesværdi (NSD) for den platinfølsomme cellelinje (A2780) fra 0,7 til 0,1 på 8 timer. I modsætning hertil forbliver NSD-værdien af ​​den platinresistente cellelinje (A2780-CP70) næsten konstant (0,81 til 0,80) 9 timer efter påføring af lægemiddel. NSD-værdien af ​​normalt musevæv knyttet til tumorxenotransplantatet falder kun lidt (0,6 til 0,52) sammenlignet med A2780. Fig. 2 viser cisplatinlægemiddelresponskurverne. NSD-værdien for hvert punkt beregnes som gennemsnit over hele målet. Tiden mellem målinger er 24 minutter for A2780-CP70 og normalt musevæv og er 12 minutter for A2780. 20 μM cisplatin blev påført på tidspunktet t = 0, og målingerne varede 9 timer for A2780-CP70 og normalt musevæv og varede 8 timer for A2780. Ved tidspunktet = 0 har den aggressive cellelinje A2780-CP70 den højeste NSD, og ​​den normale muse mesenteriumvæv har den laveste NSD (0,6). NSD for den platinfølsomme cellelinje A2780 ligger i midten: 0,7. Efter påføring af cisplatin falder NSD-kurven for A2780 øjeblikkeligt. NSD-værdien af ​​A2780-CP70 ændres næsten ikke.

Fig. 2 Motilitetsmetrik (NSD) for ovariecancertumor xenografter, der reagerer på 20 μM cisplatin. X-aksen er tid (minut), y-aksen er NSD-værdi. Den følsomme tumor er A2780, mens den ufølsomme tumor A2780-CP70. Begge tumorvæv begynder med højere motilitet end normalt musevæv. Cisplatinet blev tilsat på tidspunktet t=0. NSD af A2780 faldt meget hurtigt, og efter 8 timer faldt den til 0,1. NSD for den ufølsomme tumor A2780-CP70 ændrede sig ikke i løbet af 9 timer. NSD for normalt musevæv faldt lidt sammenlignet med A2780.

I en yderligere undersøgelse i et veterinært klinisk miljø er MCT blevet brugt til at forudsige patientudfald for non-Hodgkins lymfom hos hunde. Canine non-Hodgkins lymfomer er oprindeligt karakteriseret ved tumoral infiltration af perifere lymfeknuder. Canine non-Hodgkins lymfomer er forskellige i deres kliniske aggressivitet og respons på kemoterapi. Den eneste nuværende biomarkør for kemorespons er tumorcelleimmunofenotype (dvs. T-celle vs. B-celle oprindelse), men kemoresponsiviteten varierer enormt inden for immunfænotype, hvilket reducerer den kliniske anvendelighed af denne biomarkør. I vores undersøgelse brugte vi MCT til at måle det heterogene respons af hundelymfombiopsier på standard-of-care doxorubicin. De biodynamiske signaturer af doxorubicin-responsivitet ex vivo var korreleret med resultatet hos hundepatienter. Disse undersøgelser har for første gang vist nytten af ​​mærkefrie intracellulære biodynamiske markører til at forudsige terapeutisk effekt til kræftbehandling hos hunde.

SPECIFIKKE MÅL Det primære studiemål er at undersøge muligheden for at bruge MCT som et kemosensitivitetsassay blandt brystkræftpatienter, der modtager neoadjuverende kemoterapi, ved at sammenligne MCT-mønstre i overensstemmelse med kemoterapirespons eller resistens ex-vivo over for bekræftet respons eller resistens over for kemoterapi målt ved responsevaluering Kriterier i solide tumorer (RECIST) v1.1 kriterier.

PRIMÆRT ENDPUNT: Objektiv patologisk respons målt på operationstidspunktet.