유방암 환자를 위한 Onco4D(TM) 생체역학 화학요법 선택

연구 근거: 종양 이종이식을 정확하게 평가하는 MCT의 입증된 능력은 치료에 대한 예측 반응을 기반으로 환자 종양 계층화를 위한 신뢰할 수 있는 기술로 확립할 수 있으며, 이를 통해 개별 환자의 개인적 필요에 따라 치료 선택을 가능하게 할 수 있습니다. 이 연구는 유방암의 신보조 및 보조 치료에 일상적으로 사용되는 화학요법제로 치료에 대한 화학 감수성을 예측하기 위한 분석으로 MCT를 평가하도록 설계되었습니다. 긍정적인 경우, 이 연구의 결과는 확장된 임상 시험 및 치료 선택에서 MCT 사용의 기초를 제공할 것입니다.

배경: 라이브 셀 이미징은 고함량 분석 및 약물 발견 응용 분야의 표준이 되었습니다. 살아있는 세포에 대한 가장 일반적인 분석에는 세포 생리학 및 기능이 제노바이오틱스의 적용된 섭동에 반응하여 측정되기 때문에 생존력, 증식 및 세포독성 분석이 포함됩니다. 세포 및 조직 생존능 분석은 일반적으로 막 완전성 또는 세포 대사 활동의 바이오마커로서 외인성 필수 염료를 사용하여 측정됩니다. 그러나 염료는 침습적이고 잠재적으로 독성이 있으며 종종 조직의 고정 또는 막의 투과성을 필요로 합니다[1, 2]. 또한, 고함량 분석 및 유세포 분석의 일반적인 형식에는 분리된 세포 또는 평평하고 단단한 표면에 분포된 세포가 필요합니다. 분리된 세포는 건강한 조직의 특징인 생물학적으로 관련된 세포간 연결 및 통신이 부족하며 [3, 4], 플레이트의 평평한 세포는 병리학적 모양과 비등방성 세포 유착을 가집니다 [5].

암 치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 기술의 발견이 시급한 과제입니다. 생체 외에서 약물에 대한 초기 반응을 평가하기 위한 많은 기술이 존재하지만, 2D에서의 약물 반응이 종종 동일하지 않기 때문에 3차원 조직 또는 배양에서 생존력, 세포 독성 및 증식 분석을 수행할 필요성이 점점 더 시급해지고 있습니다[6, 7]. 생물학적으로 관련된 3차원 배양에서 약물 반응으로서. 이것은 부분적으로 게놈 프로필이 단층 배양에서 보존되지 않기 때문입니다[8-10]. 3차원 배양과 비교하여 2D 배양에서 다르게 발현되는 세포 생존, 증식, 분화 및 치료에 대한 내성과 관련된 유전자의 발현을 추적한 여러 연구가 있었습니다. 예를 들어, 상피성 난소암[11, 12], 간세포 암종[13-15] 또는 결장암[16]의 세포주는 3차원 배양에서 측정할 때 종양 조직에서와 유사한 발현 프로파일을 나타내지만, 2D. 또한, 3D 배양의 3차원 환경은 2D 단층 배양과 다른 약동학을 나타내어 항암제 민감도의 차이를 생성합니다[17-20]. 마지막으로, 대부분의 최신 기술은 파괴적인 종점 평가에 의존하여 시간 경과에 따른 치료 반응의 의미 있는 종단 관찰을 방지합니다.

약물 반응 분석을 3차원과 4차원으로 마이그레이션하는 데 있어 주요 과제 중 하나는 살아있는 조직 내부의 깊은 곳(최대 1밀리미터)에서 중요한 정보를 추출하는 방법을 찾는 것이었습니다. 조직은 반투명하고 빛은 수 센티미터까지 확산될 수 있습니다. 또한, 살아있는 세포의 동적 움직임은 조직에서 난반사된 빛의 동적 반점으로 측정될 수 있는 산란된 광 필드에서 위상 변동을 생성하는 동적 광 산란을 유발합니다. 이것은 확산 파동 분광법(DWS)[21, 22] 및 확산 상관 분광법(DCS)[23-26]의 기초이지만 이러한 기술에는 깊이 분해능이 부족합니다. 조직에서 빛의 전파를 특성화하는 강력한 도구는 간섭계를 사용하는 것입니다[27]. 간섭계 검출은 OCT(optical coherence tomography)[28-31]의 기본 프로세스이며, 이는 스펙클[32-34]을 억제하는 포인트 스캔 기술입니다. 이것은 세포내 유변학을 측정하고[35], 세포사멸의 동적 신호를 찾는 데 사용되었습니다[36]. 위상차 현미경[38]을 사용하여 세포 분해능에서 전송도 감지할 수 있지만 이 접근법은 두꺼운 조직에서 사용할 수 없습니다.

Nolte 박사와 동료들은 광역 조명 디지털 홀로그래피의 높은 스펙클 대비와 결합된 저간섭 간섭계의 깊이 선택성의 이점을 사용하는 체적 분해 조직 동적 이미징을 개발했습니다. 이 기술은 Motility Contrast Tomography(MCT)라고 하며 저간섭 디지털 홀로그래피를 사용하여 살아있는 세포의 동적 움직임으로 인한 광 산란으로부터 반점 역학을 측정하기 위해 살아있는 조직에 최대 1밀리미터까지 침투합니다[37]. 그것은 이전에 항유사분열 약물의 효능을 연구하기 위한 세포독성 분석으로 적용되었습니다[40]. 본질적으로 이 기술은 세포 소기관의 '움직임'을 프로파일링하여 작동합니다. 소기관 움직임의 특정 변화는 화학 요법 치료에 대한 반응을 겪고 있는 세포에서 매우 초기에 감지할 수 있으며 화학 요법 반응의 조기 예측 인자로 사용할 수 있습니다.

MCT는 OCI(Optical Coherence Imaging)를 기반으로 합니다[38]. OCI는 후방 산란 스펙클을 수집하는 전체 필드 단간섭 홀로그래피[39]입니다. 일관성 게이팅의 도움으로 OCI는 최대 1mm 깊이의 조직을 광학적으로 절단할 수 있습니다. MCT는 특히 3차원 생체 조직 내부의 서브미크론 세포 이하 운동을 특성화하기 위해 내인성 대비로 세포 내 운동을 사용합니다[42].

그림 1은 MCT의 홀로그램 기록 원리를 보여줍니다. 캘리브레이션 후 짧은 일관성 빛은 먼저 대상 빔과 참조 빔으로 나뉩니다. 대물 빔이 살아있는 조직 샘플에 닿고 조직에서 후방 산란된 반점이 렌즈 L1에 의해 수집됩니다. 살아있는 조직 샘플은 렌즈 L1의 초점면에 위치하므로 L1은 후방 산란광의 광학 푸리에 변환도 수행합니다. 전하 결합 소자(CCD)는 L1의 다른 초점면에 위치하므로 조직에서 푸리에 변환된 산란광을 포착합니다. 참조 빔은 물체와 참조 빔 사이의 제로 경로 일치를 수행하기 위해 참조 빔의 경로 길이를 조정하기 위해 지연 단계(그림에는 표시되지 않음)에 의해 제어됩니다. 빔 스플리터는 두 빔을 결합하고 제로 경로 일치이기 때문에 CCD 평면에서 간섭합니다. 기준 빔은 축외 구성에서 20° 기울어져 있으며 간섭 줄무늬(Λ)의 간격은 3픽셀(24μm)입니다. 스펙클 크기(aspec)는 3개의 프린지 너비(70μm)로 조정됩니다. 실험 설정에 대한 추가 세부 사항은 참조 [41]에서 찾을 수 있습니다.

그림 1. 다세포 종양 회전 타원체에 대한 MCT의 원리. 생물학적 샘플은 렌즈 L1의 이미지 평면에 위치합니다. 샘플의 후방 산란광은 L1에 의해 푸리에 변환되고 CCD 칩의 참조 빔과 간섭됩니다. 스펙클 홀로그램은 기준 빔과 교차하는 각도가 20°인 푸리에 평면에 기록됩니다. a) 원시 디지털 홀로그램, b) 재구성된 이미지; c) MCI 이미지. O.A.: 광축; I.P.: 이미지 평면; L1: 렌즈; BS: 빔 스플리터; CCD: 전하 결합 장치.

생체외 암 화학감수성 분석 MCT는 이전에 다세포 종양 회전 타원체를 사용하여 항유사분열 약물의 효능을 연구하기 위해 적용되었습니다[40]. MCT를 종양 이종이식에 적용할 때 시스플라틴 하에서 두 세포주 사이에 상당히 다른 반응을 보일 수도 있습니다. 약물 적용 후 백금 민감성 세포주(A2780)의 정규화표준편차(NSD) 값이 8시간 만에 0.7에서 0.1로 떨어졌다. 대조적으로 백금 내성 세포주(A2780-CP70)의 NSD 값은 약물 적용 9시간 후 거의 일정하게(0.81~0.80) 유지됩니다. 종양 이종이식편에 부착된 정상 마우스 조직의 NSD 값은 A2780에 비해 약간만 감소합니다(0.6~0.52). 그림 2는 시스플라틴 약물 반응 곡선을 보여줍니다. 각 포인트의 NSD 값은 전체 대상에 대해 평균화됩니다. 측정 사이의 시간은 A2780-CP70 및 일반 마우스 조직의 경우 24분이고 A2780의 경우 12분입니다. 20 μM 시스플라틴은 시간 t = 0에 적용되었고 측정은 A2780-CP70 및 정상 마우스 조직에 대해 9시간 지속되었고 A2780에 대해 8시간 지속되었습니다. 시간=0에서, 공격성 세포주 A2780-CP70은 가장 높은 NSD를 갖고 정상 마우스 장간막 조직은 가장 낮은 NSD(0.6)를 갖는다. 백금 민감성 세포주 A2780의 NSD는 0.7의 중간에 있습니다. 시스플라틴을 적용한 후 A2780의 NSD 곡선이 즉시 떨어집니다. A2780-CP70의 NSD 값은 거의 변하지 않습니다.

그림 2 20μM 시스플라틴에 반응하는 난소암 종양 이종이식편의 운동성 측정(NSD). x축은 시간(분), y축은 NSD 값입니다. 민감한 종양은 A2780이고 둔감한 종양은 A2780-CP70입니다. 두 종양 조직 모두 정상 마우스 조직보다 더 높은 운동성으로 시작합니다. 시스플라틴은 시간 t=0에 추가되었습니다. A2780의 NSD는 매우 빠르게 떨어졌고 8시간 후에는 0.1로 떨어졌습니다. 무감각 종양 A2780-CP70의 NSD는 9시간 동안 변하지 않았다. 정상 마우스 조직의 NSD는 A2780에 비해 약간 떨어졌다.

수의학 임상 환경의 추가 연구에서 MCT는 개의 비호지킨 림프종에 대한 환자 결과를 예측하는 데 사용되었습니다. 개 비호지킨 림프종은 초기에 말초 림프절의 종양 침윤을 특징으로 합니다. 개 비호지킨 림프종은 임상적 공격성과 화학 요법에 대한 반응이 다양합니다. 화학 반응성에 대한 유일한 현재 바이오마커는 종양 세포 면역표현형(즉, T 세포 대 B 세포 기원), 그러나 화학반응성은 면역 표현형 내에서 엄청나게 다양하여 이 바이오마커의 임상적 유용성을 감소시킵니다. 본 연구에서는 MCT를 사용하여 표준 치료 독소루비신에 대한 개 림프종 생검의 이질적인 반응을 측정했습니다. 생체외 독소루비신 반응성의 생체역학적 특성은 송곳니 환자 결과와 상관관계가 있었습니다. 이 연구는 개의 암 치료에 대한 치료 효능을 예측하기 위해 라벨이 없는 세포내 생물역학 마커의 유용성을 처음으로 입증했습니다.

구체적인 목적 1차 연구 목적은 반응 평가로 측정한 화학요법에 대한 확인된 반응 또는 내성에 대한 생체외 화학요법 반응 또는 내성과 일치하는 MCT 패턴을 비교하여 신보강 화학요법을 받는 유방암 환자에서 화학감수성 분석법으로 MCT를 사용하는 타당성을 조사하는 것입니다. 고형 종양 기준(RECIST) v1.1 기준.

일차 종점: 수술 당시 측정된 객관적인 병리학적 반응.