Seleção de quimioterapia biodinâmica Onco4D(TM) para pacientes com câncer de mama

FUNDAMENTAÇÃO DO ESTUDO: A capacidade demonstrada do MCT para avaliar com precisão os xenoenxertos tumorais pode estabelecê-lo como uma técnica confiável para a estratificação do tumor do paciente com base na resposta prevista à terapia, o que pode permitir uma seleção de tratamento com base nas necessidades pessoais de um paciente individual. Este estudo foi concebido para avaliar o MCT como um ensaio para prever a quimiossensibilidade ao tratamento com agentes quimioterápicos usados ​​rotineiramente no tratamento neoadjuvante e adjuvante do câncer de mama. Se positivo, os resultados deste estudo fornecerão a base para ensaios clínicos expandidos e uso de MCT na seleção de terapia.

ANTECEDENTES: A imagem de células vivas tornou-se o padrão para análises de alto conteúdo e aplicações de descoberta de drogas. Os ensaios mais comuns em células vivas incluem ensaios de viabilidade, proliferação e citotoxicidade, já que a fisiologia celular e a função são medidas em resposta a perturbações aplicadas de xenobióticos. Os ensaios de viabilidade celular e tecidual são tipicamente medidos usando corantes vitais exógenos como biomarcadores da integridade da membrana ou atividade metabólica celular. No entanto, os corantes são invasivos, potencialmente tóxicos e muitas vezes requerem fixação do tecido ou permeabilização das membranas [1, 2]. Além disso, o formato comum de análise de alto conteúdo e citometria de fluxo requer células isoladas ou células distribuídas em superfícies duras planas. As células isoladas carecem de muitas das conexões e comunicações intercelulares biologicamente relevantes que são características do tecido saudável [3, 4], e as células achatadas em placas têm formas patológicas e adesões celulares anisotrópicas [5].

A descoberta da tecnologia que pode prever a resposta à terapia do câncer é uma prioridade urgente. Embora existam muitas tecnologias para avaliar a resposta precoce a drogas ex vivo, a necessidade de realizar ensaios de viabilidade, citotoxicidade e proliferação em tecidos ou culturas tridimensionais tornou-se cada vez mais urgente [6, 7], pois a resposta a drogas em 2D geralmente não é a mesma como resposta a drogas em cultura tridimensional biologicamente relevante. Isso ocorre em parte porque os perfis genômicos não são preservados em culturas de monocamada [8-10]. Existem vários estudos que rastrearam a expressão de genes associados à sobrevivência, proliferação, diferenciação e resistência celular à terapia que se expressam de maneira diferente em culturas 2D em relação à cultura tridimensional. Por exemplo, linhagens celulares de câncer de ovário epitelial [11, 12], carcinoma hepatocelular [13-15] ou câncer de cólon [16] exibem perfis de expressão mais semelhantes aos de tecidos tumorais quando medidos em cultura tridimensional, mas não quando cultivados em 2D. Além disso, o ambiente tridimensional da cultura 3D apresenta farmacocinética diferente da cultura 2D em monocamada e produz diferenças nas sensibilidades aos medicamentos contra o câncer [17-20]. Finalmente, a maioria das tecnologias atuais depende da avaliação destrutiva do ponto final, impedindo a observação longitudinal significativa da resposta terapêutica ao longo do tempo.

Um dos principais desafios para migrar os ensaios de resposta a drogas para a terceira e quarta dimensões tem sido encontrar um meio de extrair informações vitais das profundezas (até um milímetro) dentro do tecido vivo. O tecido é translúcido e a luz pode se propagar difusamente por muitos centímetros. Além disso, os movimentos dinâmicos das células vivas causam dispersão de luz dinâmica que produz flutuações de fase nos campos de luz espalhados que podem ser medidos como manchas dinâmicas na luz difusamente refletida do tecido. Esta é a base da espectroscopia de onda de difusão (DWS) [21, 22] e da espectroscopia de correlação de difusão (DCS) [23-26], mas essas técnicas carecem de resolução de profundidade. Uma ferramenta poderosa na caracterização da propagação da luz nos tecidos é o uso da interferometria [27]. A detecção interferométrica é o processo subjacente na tomografia de coerência óptica (OCT) [28-31], que é uma técnica de varredura de pontos que suprime o speckle [32-34], embora a decorrelação do speckle nos dados da OCT possa fornecer informações semelhantes às fornecidas pelo DCS. Isso tem sido usado para medir a reologia intracelular [35] e encontrar assinaturas dinâmicas de apoptose [36]. O transporte também pode ser detectado na resolução celular usando microscopia de contraste de fase [38], mas essa abordagem não pode ser usada em tecidos espessos.

O Dr. Nolte e seus colegas desenvolveram imagens dinâmicas de tecidos resolvidos volumetricamente que usam as vantagens da seletividade de profundidade da interferometria de baixa coerência, combinada com alto contraste de speckle na holografia digital de ampla iluminação. A técnica é chamada de Motility Contrast Tomography (MCT) e usa holografia digital de baixa coerência para penetrar até 1 milímetro no tecido vivo para medir a dinâmica do speckle da dispersão da luz do movimento dinâmico em células vivas [37]. Foi previamente aplicado como um ensaio de citotoxicidade para estudar a eficácia de drogas anti-mitóticas [40]. Em essência, a tecnologia funciona traçando o perfil do 'movimento' das organelas celulares. Mudanças específicas no movimento de organelas são detectáveis ​​muito precocemente em células em resposta ao tratamento quimioterápico e podem ser usadas como um preditor precoce da resposta quimioterápica.

O MCT é baseado na imagem de coerência óptica (OCI) [38]. OCI é uma holografia de coerência curta de campo completo [39] que coleta speckle retroespalhado. Com a ajuda do gating de coerência, o OCI pode seccionar opticamente tecidos de até 1 mm de profundidade. O MCT usa especificamente o movimento intracelular como contraste endógeno para caracterizar o movimento subcelular submicrométrico dentro do tecido vivo tridimensional [42].

A Figura 1 mostra o princípio de gravação holográfica do MCT. Após a calibração, a luz de coerência curta é primeiro dividida em um feixe de objeto e um feixe de referência. O feixe do objeto atinge a amostra de tecido vivo e as manchas retroespalhadas do tecido são coletadas pela lente L1. A amostra de tecido vivo localiza-se no plano focal da lente L1, de modo que L1 também executa uma transformada óptica de Fourier da luz retroespalhada. O dispositivo de carga acoplada (CCD) localiza-se no outro plano focal de L1, de modo que captura a luz de dispersão transformada de Fourier do tecido. O feixe de referência é controlado por um estágio de atraso (não mostrado na figura) para ajustar o comprimento do caminho do feixe de referência para realizar uma correspondência de caminho zero entre o objeto e os feixes de referência. O divisor de feixe combina os dois feixes e, como são de caminho zero, eles interferem no plano CCD. O feixe de referência é inclinado em 20° em uma configuração fora do eixo, e o espaçamento das franjas de interferência (Λ) é de 3 pixels (24 μm). O tamanho do speckle (aspec) é ajustado para ter 3 franjas de largura (70 μm). Detalhes adicionais sobre a configuração experimental podem ser encontrados na referência [41].

Figura 1. O princípio da MCT em esferoides tumorais multicelulares. A amostra biológica está localizada no plano de imagem da lente L1. A luz retrodispersa da amostra é transformada por Fourier por L1 e interfere com o feixe de referência no chip CCD. O holograma speckle é registrado no plano de Fourier com um ângulo de cruzamento de 20 com o feixe de referência. Exemplos de a) Holograma digital bruto; b) imagem reconstruída; c) imagem MCI. O.A.: eixo óptico; I.P.: plano da imagem; L1: lente; BS: divisor de feixe; CCD: dispositivo de carga acoplada.

ANÁLISE DE QUIMOSSENSIBILIDADE DE CÂNCER EX VIVO MCT foi previamente aplicado para estudar a eficácia de drogas anti-mitóticas usando esferoides tumorais multicelulares [40]. Ao aplicar MCT a xenoenxertos tumorais, também é capaz de mostrar uma resposta significativamente diferente entre duas linhas celulares sob cisplatina. Após a aplicação do medicamento, o valor do desvio padrão normalizado (NSD) da linha celular sensível à platina (A2780) cai de 0,7 para 0,1 em 8 horas. Em contraste, o valor NSD da linha celular resistente à platina (A2780-CP70) permanece quase constante (0,81 a 0,80) 9 horas após a aplicação da droga. O valor NSD de tecido de camundongo normal ligado ao xenoenxerto tumoral diminui apenas um pouco (0,6 a 0,52) em comparação com A2780. A Fig. 2 mostra as curvas de resposta à droga cisplatina. O valor NSD de cada ponto é calculado em média sobre o alvo inteiro. O tempo entre as medições é de 24 minutos para A2780-CP70 e tecido de camundongo normal e é de 12 minutos para A2780. A cisplatina 20 μM foi aplicada no tempo t = 0, e as medições duraram 9 horas para A2780-CP70 e tecido normal de camundongo, e duraram 8 horas para A2780. No tempo = 0, a linha celular agressiva A2780-CP70 tem o NSD mais alto e o tecido de mesentério de camundongo normal tem o NSD mais baixo (0,6). O NSD da linha celular A2780 sensível à platina está no meio: 0,7. Após a aplicação da cisplatina, a curva NSD de A2780 cai imediatamente. O valor NSD do A2780-CP70 quase não muda.

Fig. 2 Métrica de motilidade (NSD) de xenoenxertos de tumor de câncer de ovário respondendo a 20 μM de cisplatina. O eixo x é o tempo (minutos), o eixo y é o valor NSD. O tumor sensível é A2780, enquanto o tumor insensível A2780-CP70. Ambos os tecidos tumorais começam com maior motilidade do que o tecido normal do camundongo. A cisplatina foi adicionada no tempo t=0. O NSD do A2780 caiu muito rápido e após 8 horas caiu para 0,1. O NSD do tumor insensível A2780-CP70 não mudou durante o período de 9 horas. O NSD do tecido normal do camundongo caiu um pouco em comparação com o A2780.

Em um estudo adicional em um ambiente clínico veterinário, o MCT foi usado para prever o resultado do paciente para o linfoma não-Hodgkin canino. Os linfomas não-Hodgkin caninos são inicialmente caracterizados por infiltração tumoral de linfonodos periféricos. Os linfomas não-Hodgkin caninos são diversos em sua agressividade clínica e resposta à quimioterapia. O único biomarcador atual para quimiorresponsividade é o imunofenótipo de células tumorais (ou seja, Célula T vs. Origem da célula B), mas a quimiorresponsividade varia tremendamente dentro do imunofenótipo, o que reduz a utilidade clínica deste biomarcador. Em nosso estudo, usamos o MCT para medir a resposta heterogênea de biópsias de linfoma canino à doxorrubicina padrão. As assinaturas biodinâmicas da responsividade à doxorrubicina ex vivo foram correlacionadas com o resultado do paciente canino. Esses estudos demonstraram, pela primeira vez, a utilidade de marcadores biodinâmicos intracelulares livres de marcadores para prever a eficácia terapêutica no tratamento do câncer em cães.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS O objetivo principal do estudo é examinar a viabilidade do uso do MCT como um ensaio de quimiossensibilidade entre pacientes com câncer de mama recebendo quimioterapia neoadjuvante, comparando os padrões de MCT consistentes com a resposta à quimioterapia ou resistência ex-vivo à resposta confirmada ou resistência à quimioterapia conforme medido pela Avaliação de Resposta Critérios em Tumores Sólidos (RECIST) v1.1 critérios.

ENDPOINT PRIMÁRIO: Resposta patológica objetiva medida no momento da cirurgia.