Onco4D(TM) Biodynaaminen kemoterapiavalinta rintasyöpäpotilaille

TUTKIMUKSEN PERUSTELUT: MCT:n osoitettu kyky arvioida tuumoriksenografteja tarkasti saattaa tehdä siitä luotettavan tekniikan potilaan kasvainten kerrostukseen, joka perustuu ennustettuun hoitovasteeseen, mikä voisi mahdollistaa hoidon valinnan yksittäisen potilaan henkilökohtaisten tarpeiden perusteella. Tämä tutkimus on suunniteltu arvioimaan MCT:tä analyysinä kemosensitiivisyyden ennustamiseksi hoidolle kemoterapia-aineilla, joita käytetään rutiininomaisesti rintasyövän neoadjuvantti- ja adjuvanttihoidossa. Jos tämän tutkimuksen tulokset ovat positiivisia, ne tarjoavat perustan laajemmille kliinisille tutkimuksille ja MCT:n käytölle hoidon valinnassa.

TAUSTA: Elävien solujen kuvantamisesta on tullut standardi korkean sisällön analysointi- ja lääketutkimussovelluksissa. Yleisimmät elävien solujen määritykset sisältävät elinkelpoisuus-, proliferaatio- ja sytotoksisuusmääritykset, koska solun fysiologiaa ja toimintaa mitataan vasteena ksenobioottien sovellettaviin häiriöihin. Solujen ja kudosten elinkelpoisuusmääritykset mitataan tyypillisesti käyttämällä eksogeenisiä elintärkeitä väriaineita kalvon eheyden tai solun metabolisen aktiivisuuden biomarkkereina. Värit ovat kuitenkin invasiivisia, mahdollisesti myrkyllisiä ja vaativat usein kudoksen kiinnittämistä tai kalvojen läpäisemistä [1, 2]. Lisäksi yleinen korkean sisällön analyysin ja virtaussytometrian muoto vaatii eristettyjä soluja tai soluja, jotka on jaettu tasaisille koville pinnoille. Eristetyistä soluista puuttuu monia biologisesti merkittäviä solujen välisiä yhteyksiä ja kommunikaatioita, jotka ovat terveen kudoksen tunnusmerkkejä [3, 4], ja levyillä olevilla litteillä soluilla on patologinen muoto ja anisotrooppinen soluadheesio [5].

Teknologian löytäminen, joka voi ennustaa vasteen syövän hoitoon, on kiireellinen prioriteetti. Vaikka on olemassa monia tekniikoita, joilla arvioidaan varhaista vastetta lääkkeisiin ex vivo, tarve suorittaa elinkelpoisuus-, sytotoksisuus- ja proliferaatiomääritykset kolmiulotteisessa kudoksessa tai viljelmässä on tullut yhä kiireellisemmäksi [6, 7], koska lääkevaste 2D:ssä ei useinkaan ole sama. lääkevasteena biologisesti relevantissa kolmiulotteisessa viljelmässä. Tämä johtuu osittain siitä, että genomiprofiilit eivät säily yksikerrosviljelmissä [8-10]. On tehty useita tutkimuksia, jotka ovat seuranneet sellaisten geenien ilmentymistä, jotka liittyvät solujen eloonjäämiseen, lisääntymiseen, erilaistumiseen ja terapian vastustuskykyyn ja jotka ilmentyvät eri tavalla 2D-viljelmissä verrattuna kolmiulotteiseen viljelyyn. Esimerkiksi epiteelisyövän [11, 12], hepatosellulaarisen karsinooman [13-15] tai paksusuolensyövän [16] solulinjat näyttävät ilmentymisprofiilit enemmän kuin kasvainkudosten ilmentymisprofiilit, kun ne mitataan kolmiulotteisessa viljelmässä, mutta eivät kasvatettuina 2D. Lisäksi 3D-viljelmän kolmiulotteisessa ympäristössä on erilainen farmakokinetiikka kuin 2D-yksikerrosviljelmällä ja se tuottaa eroja syöpälääkkeiden herkkyydessä [17-20]. Lopuksi useimmat nykyiset tekniikat perustuvat tuhoavaan päätepisteen arviointiin, mikä estää hoidon vasteen merkityksellisen pitkittäisen havainnoinnin ajan mittaan.

Yksi suurimmista haasteista lääkevastemääritysten siirtämisessä kolmanteen ja neljänteen ulottuvuuteen on ollut löytää keino poimia elintärkeää tietoa syvältä (jopa millimetriin) elävän kudoksen sisältä. Kudos on läpikuultava ja valo voi levitä diffuusisesti monta senttimetriä. Lisäksi elävien solujen dynaamiset liikkeet aiheuttavat dynaamista valonsirontaa, joka tuottaa sironneiden valokenttien vaihevaihteluita, jotka voidaan mitata dynaamisina pilkkuina kudoksesta hajaheijastuneessa valossa. Tämä on diffuusioaaltospektroskopian (DWS) [21, 22] ja diffuusiokorrelaatiospektroskopian (DCS) [23-26] perusta, mutta näiltä tekniikoilta puuttuu syvyysresoluutio. Tehokas työkalu valon etenemisen karakterisoinnissa kudoksissa on interferometrian käyttö [27]. Interferometrinen havaitseminen on taustalla oleva prosessi optisessa koherenssitomografiassa (OCT) [28-31], joka on pisteskannaustekniikka, joka vaimentaa pilkkua [32-34], vaikka OCT-tiedon pilkkudekorrelaatio voi tarjota samanlaista tietoa kuin DCS. Tätä on käytetty intrasellulaarisen reologian mittaamiseen [35] ja apoptoosin dynaamisten allekirjoitusten löytämiseen [36]. Kuljetus voidaan havaita myös soluresoluutiolla faasikontrastimikroskoopilla [38], mutta tätä lähestymistapaa ei voida käyttää paksuissa kudoksissa.

Dr. Nolte ja kollegat ovat kehittäneet volyymierotteisen kudosdynaamisen kuvantamisen, jossa hyödynnetään matalan koherenssin interferometrian syvyysselektiivisyyden etuja yhdistettynä korkeaan pilkkukontrastiin laajavalaistussa digitaalisessa holografiassa. Tekniikka on nimeltään Motility Contrast Tomography (MCT), ja se käyttää matalakoherenssista digitaalista holografiaa tunkeutumaan jopa 1 millimetriin elävään kudokseen mittaamaan täplädynamiikkaa elävien solujen dynaamisesta liikkeestä johtuvasta valon sironnasta [37]. Sitä käytettiin aiemmin sytotoksisuusmäärityksessä antimitoottisten lääkkeiden tehon tutkimiseen [40]. Pohjimmiltaan tekniikka toimii profiloimalla soluorganellien "liikettä". Spesifiset muutokset organellien liikkeessä ovat havaittavissa hyvin varhain soluissa, jotka reagoivat kemoterapiahoitoon, ja niitä voidaan käyttää varhaisena kemoterapiavasteen ennustajana.

MCT perustuu optiseen koherenssikuvaukseen (OCI) [38]. OCI on täyden kentän lyhytkoherenssiholografia [39], joka kerää takaisinsironneita pilkkuja. Koherenssiportin avulla OCI voi optisesti leikata kudosta jopa 1 mm:n syvyyteen. MCT käyttää erityisesti solunsisäistä liikettä endogeenisenä kontrastina luonnehtimaan submikronista subsellulaarista liikettä kolmiulotteisen elävän kudoksen sisällä [42].

Kuvassa 1 on esitetty MCT:n holografinen tallennusperiaate. Kalibroinnin jälkeen lyhyt koherenssivalo jaetaan ensin kohdesäteeseen ja vertailusäteeseen. Kohdesäde osuu elävään kudosnäytteeseen, ja linssi L1 kerää takaisin sironneet täplät kudoksesta. Elävä kudosnäyte sijoittuu linssin L1 polttotasolle, joten L1 suorittaa myös takaisinsironneen valon optisen Fourier-muunnoksen. Varauskytkentälaite (CCD) sijoittuu L1:n toiseen polttotasoon, joten se vangitsee Fourier-muunnetun sirontavalon kudoksesta. Referenssisädettä ohjataan viivevaiheella (ei näy kuvassa) referenssisäteen polun pituuden säätämiseksi niin, että kohteen ja vertailusäteen välinen nollapolku täsmäytys. Säteenjakaja yhdistää molemmat säteet ja koska ne on sovitettu nollapolkuun, ne häiritsevät CCD-tasossa. Referenssisäde on kallistettu 20° akselin ulkopuolisessa konfiguraatiossa, ja häiriöreunojen etäisyys (Λ) on 3 pikseliä (24 μm). Pilkun koko (aspec) on säädetty 3 hapsua leveäksi (70 μm). Lisätietoja kokeellisesta asetelmasta löytyy viitteestä [41].

Kuva 1. MCT:n periaate monisoluisissa kasvainsferoideissa. Biologinen näyte sijaitsee linssin L1 kuvatasolla. Näytteestä takaisin sironnut valo on Fourier-muunnettu L1:llä ja se häiritsee CCD-sirun vertailusädettä. Täplähologrammi tallennetaan Fourier-tasolle 20:n risteävällä enkelillä vertailusäteen kanssa. Esimerkkejä a) Raaka digitaalinen hologrammi; b) rekonstruoitu kuva; c) MCI-kuva. O.A.: optinen akseli; I.P.: kuvataso; L1: linssi; BS: säteen jakaja; CCD: lataus kytketty laite.

EX VIVO Syövän KEMOSENSITIIVINEN ANALYYSI MCT:tä käytettiin aiemmin tutkimaan antimitoottisten lääkkeiden tehoa käyttämällä monisoluisia kasvainsferoideja [40]. Kun MCT:tä käytetään tuumoriksenografteihin, se pystyy myös osoittamaan merkittävästi erilaisen vasteen kahden solulinjan välillä sisplatiinin alla. Lääkkeen levittämisen jälkeen platinaherkän solulinjan (A2780) normalisoitu keskihajonta (NSD) putoaa 0,7:stä 0,1:een 8 tunnissa. Sitä vastoin platinaresistentin solulinjan (A2780-CP70) NSD-arvo pysyy lähes vakiona (0,81 - 0,80) 9 tuntia lääkkeen levittämisen jälkeen. Kasvainksenograftiin kiinnittyneen normaalin hiiren kudoksen NSD-arvo laskee vain vähän (0,6 - 0,52) verrattuna A2780:een. Kuvio 2 esittää sisplatiinilääkevastekäyrät. Kunkin pisteen NSD-arvo lasketaan koko kohteen keskiarvoksi. Mittausten välinen aika on 24 minuuttia A2780-CP70:lle ja normaalille hiiren kudokselle ja 12 minuuttia A2780:lle. 20 µM sisplatiinia levitettiin hetkellä t = 0, ja mittaukset kestivät 9 tuntia A2780-CP70:lle ja normaalille hiiren kudokselle ja kestivät 8 tuntia A2780:lle. Ajankohtana = 0 aggressiivisella solulinjalla A2780-CP70 on korkein NSD ja normaalilla hiiren suoliliepeen kudoksella on alhaisin NSD (0,6). Platinaherkän solulinjan A2780 NSD on keskellä: 0,7. Sisplatiinin levittämisen jälkeen A2780:n NSD-käyrä putoaa välittömästi. A2780-CP70:n NSD-arvo ei juuri muutu.

Kuva 2 Motiliteettimetriikka (NSD) munasarjasyöpäkasvainten ksenografteista, jotka reagoivat 20 µM sisplatiiniin. X-akseli on aika (minuutit), y-akseli on NSD-arvo. Herkkä kasvain on A2780, kun taas epäherkkä kasvain A2780-CP70. Molemmat kasvainkudokset alkavat suuremmalla liikkuvuudella kuin normaali hiiren kudos. Sisplatiini lisättiin hetkellä t = 0. A2780:n NSD putosi erittäin nopeasti ja 8 tunnin kuluttua se putosi 0,1:een. Epäherkän kasvaimen A2780-CP70 NSD ei muuttunut 9 tunnin aikana. Normaalin hiiren kudoksen NSD laski hieman verrattuna A2780:een.

Eläinlääketieteellisessä kliinisessä ympäristössä tehdyssä lisätutkimuksessa MCT:tä on käytetty ennustamaan potilaan tuloksia koiran non-Hodgkinin lymfooman osalta. Koiran non-Hodgkinin lymfoomille on aluksi ominaista perifeeristen imusolmukkeiden kasvaininfiltraatio. Koiran non-Hodgkinin lymfoomat ovat erilaisia ​​kliinisen aggressiivisuuden ja vasteen kemoterapiaan suhteen. Ainoa nykyinen kemoresponsiivisuuden biomarkkeri on kasvainsolujen immunofenotyyppi (ts. T-solu vs. B-solu alkuperä), mutta kemoresponsiivisuus vaihtelee valtavasti immunofenotyypin sisällä, mikä vähentää tämän biomarkkerin kliinistä käyttökelpoisuutta. Tutkimuksessamme käytimme MCT:tä mittaamaan koiran lymfoomabiopsioiden heterogeenistä vastetta hoidon standardinmukaiseen doksorubisiiniin. Doksorubisiinivasteen biodynaamiset allekirjoitukset ex vivo korreloivat koiran potilaan lopputulokseen. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet ensimmäistä kertaa leimattomien solunsisäisten biodynaamisten markkerien käyttökelpoisuuden ennustamaan terapeuttista tehoa koirien syövän hoidossa.

ERITYISET TAVOITTEET Tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on tutkia MCT:n käyttökelpoisuutta kemosensitiivinen määrityksenä rintasyöpäpotilailla, jotka saavat neoadjuvanttikemoterapiaa vertaamalla MCT-kuvioita, jotka ovat yhdenmukaisia ​​kemoterapiavasteen tai resistenssin kanssa ex vivo vahvistettuun vasteeseen tai resistenssiin kemoterapiaa kohtaan, mitattuna vastearvioinnilla. Criteria in Solid Tumors (RECIST) v1.1 kriteerit.

ENSISIJAINEN PÄÄTE: Objektiivinen patologinen vaste mitattuna leikkauksen aikana.