Onco4D(TM) biodynamisk kjemoterapiutvalg for brystkreftpasienter

STUDIERASJON: Den demonstrerte evnen til MCT til å nøyaktig vurdere tumor xenografts kan etablere det som en pålitelig teknikk for pasientens tumorstratifisering basert på forutsagt respons på terapi, som kan muliggjøre et behandlingsvalg basert på individuelle behov til en individuell pasient. Denne studien er designet for å vurdere MCT som en analyse for å forutsi kjemosensitivitet til behandling med kjemoterapimidler som rutinemessig brukes i neoadjuvant og adjuvant behandling av brystkreft. Hvis de er positive, vil resultatene av denne studien gi grunnlag for utvidede kliniske studier og bruk av MCT i terapivalg.

BAKGRUNN: Live cell imaging har blitt standarden for høyinnholdsanalyser og applikasjoner for oppdagelse av legemidler. De vanligste analysene på levende celler inkluderer levedyktighets-, sprednings- og cytotoksisitetsanalyser ettersom cellulær fysiologi og funksjon måles og reagerer på påførte forstyrrelser av xenobiotika. Cellulære og vevs levedyktighetsanalyser måles vanligvis ved bruk av eksogene vitale fargestoffer som biomarkører for membranintegritet eller cellulær metabolsk aktivitet. Imidlertid er fargestoffer invasive, potensielt giftige og krever ofte fiksering av vevet eller permeabilisering av membranene [1, 2]. Videre krever det vanlige formatet med høyinnholdsanalyse og flowcytometri isolerte celler, eller celler fordelt på flate harde overflater. Isolerte celler mangler mange av de biologisk relevante intercellulære forbindelsene og kommunikasjonene som er kjennetegn ved sunt vev [3, 4], og flate celler på plater har patologiske former og anisotropiske cellulære adhesjoner [5].

Oppdagelse av teknologi som kan forutsi respons på kreftbehandling er en presserende prioritet. Mens mange teknologier eksisterer for å evaluere tidlig respons på legemidler ex vivo, har behovet for å utføre levedyktighet, cytotoksisitet og spredningsanalyser i tredimensjonalt vev eller kultur blitt stadig mer presserende [6, 7], ettersom medikamentrespons i 2D ofte ikke er det samme som medikamentrespons i biologisk relevant tredimensjonal kultur. Dette er delvis fordi genomiske profiler ikke er bevart i monolagskulturer [8-10]. Det har vært flere studier som har sporet uttrykket av gener assosiert med celleoverlevelse, proliferasjon, differensiering og motstand mot terapi som uttrykkes annerledes i 2D-kulturer i forhold til tredimensjonal kultur. For eksempel viser cellelinjer av epitelial eggstokkreft [11, 12], hepatocellulært karsinom [13-15] eller tykktarmskreft [16] ekspresjonsprofiler mer som de fra tumorvev når de måles i tredimensjonal kultur, men ikke når de dyrkes i 2D. I tillegg presenterer det tredimensjonale miljøet til 3D-kultur en annen farmakokinetikk enn 2D-monolagskultur og produserer forskjeller i kreftmedisinsensitivitet [17-20]. Til slutt er de fleste nåværende teknologier avhengige av destruktiv endepunktsvurdering, og forhindrer meningsfull longitudinell observasjon av terapirespons over tid.

En av hovedutfordringene for å migrere medikamentresponsanalyser til den tredje og fjerde dimensjonen har vært å finne en måte å trekke ut viktig informasjon fra dypt (opptil en millimeter) inne i levende vev. Vev er gjennomskinnelig og lys kan forplante seg diffusivt mange centimeter. Videre forårsaker de dynamiske bevegelsene til levende celler dynamisk lysspredning som gir fasesvingninger på de spredte lysfeltene som kan måles som dynamisk flekk i diffust reflektert lys fra vev. Dette er grunnlaget for diffuserende bølgespektroskopi (DWS) [21, 22] og diffusjonskorrelasjonsspektroskopi (DCS) [23-26], men disse teknikkene mangler dybdeoppløsning. Et kraftig verktøy i karakteriseringen av lysutbredelse i vev er bruken av interferometri [27]. Interferometrisk deteksjon er den underliggende prosessen i optisk koherenstomografi (OCT) [28-31], som er en punktskanningsteknikk som undertrykker flekk [32-34], selv om flekkdekorrelasjon i OCT-data kan gi lignende informasjon som gitt av DCS. Dette har blitt brukt til å måle intracellulær reologi [35] og for å finne dynamiske signaturer på apoptose [36]. Transport kan også oppdages ved cellulær oppløsning ved bruk av fasekontrastmikroskopi [38], men denne tilnærmingen kan ikke brukes i tykt vev.

Dr. Nolte og kollegaer har utviklet volumetrisk løst dynamisk vevsavbildning som bruker fordelene med dybdeselektivitet fra lavkoherens interferometri, kombinert med høy flekkkontrast i digital holografi med bred belysning. Teknikken kalles Motility Contrast Tomography (MCT) og bruker lavkoherens digital holografi for å penetrere opptil 1 millimeter inn i levende vev for å måle flekkdynamikk fra lysspredning fra dynamisk bevegelse i levende celler [37]. Det ble tidligere brukt som en cytotoksisitetsanalyse for å studere effekten av anti-mitotiske legemidler [40]. I hovedsak fungerer teknologien ved å profilere "bevegelsen" til cellulære organeller. Spesifikke endringer i organellbevegelse kan påvises veldig tidlig i celler som gjennomgår respons på kjemoterapibehandling, og kan være brukbare som en tidlig prediktor for kjemoterapirespons.

MCT er basert på optisk koherensavbildning (OCI) [38]. OCI er en helfelts kortkoherens-holografi [39] som samler tilbakespredt flekk. Ved hjelp av coherence gating kan OCI optisk seksjonere vev opp til 1 mm dypt. MCT bruker spesifikt intracellulær bevegelse som den endogene kontrasten for å karakterisere submikron subcellulær bevegelse inne i tredimensjonalt levende vev [42].

Figur 1 viser det holografiske registreringsprinsippet til MCT. Etter kalibrering deles det korte koherenslyset først inn i en objektstråle og en referansestråle. Objektstrålen treffer den levende vevsprøven, og tilbakespredte flekker fra vevet samles opp av linsen L1. Den levende vevsprøven lokaliserer seg ved fokalplanet til linsen L1, så L1 utfører også en optisk Fourier-transformasjon av det tilbakespredte lyset. Den ladningskoblede enheten (CCD) lokaliserer seg i det andre fokalplanet til L1, så den fanger det Fourier-transformerte spredningslyset fra vevet. Referansestrålen styres av et forsinkelsestrinn (ikke vist i figuren) for å justere banelengden til referansestrålen for å utføre en nullbanetilpasning mellom objektet og referansestrålene. Stråledeleren kombinerer begge strålene, og fordi de er nullbanetilpasset, forstyrrer de CCD-planet. Referansestrålen vippes 20° i en konfigurasjon utenfor aksen, og avstanden mellom interferenskantene (Λ) er 3 piksler (24 μm). Flekkstørrelsen (aspec) er justert til å være 3 frynser bred (70 μm). Ytterligere detaljer om det eksperimentelle oppsettet kan finnes i referanse [41].

Figur 1. Prinsippet for MCT på flercellede tumorsfæroider. Den biologiske prøven er lokalisert ved bildeplanet til linse L1. Det tilbakespredte lyset fra prøven er Fourier-transformert av L1 og forstyrret med referansestrålen på CCD-brikken. Flekkhologrammet er registrert på Fourier-planet med en 20 kryssende engel med referansestrålen. Eksempler på a) Rå digitalt hologram; b) rekonstruert bilde; c) MCI-bilde. O.A.: optisk akse; I.P.: bildeplan; L1: linse; BS: stråledeler; CCD: ladekoblet enhet.

EX VIVO KREFT KJEMOSENSITIVITETSANALYSE MCT ble tidligere brukt for å studere effekten av antimitotiske legemidler ved bruk av multicellulære tumorsfæroider [40]. Når MCT påføres på tumor xenografter, er det også i stand til å vise en signifikant forskjellig respons mellom to cellelinjer under cisplatin. Etter påføring av stoffet synker den normaliserte standardavviksverdien (NSD) for den platinasensitive cellelinjen (A2780) fra 0,7 til 0,1 på 8 timer. I motsetning til dette forblir NSD-verdien til den platinaresistente cellelinjen (A2780-CP70) nesten konstant (0,81 til 0,80) 9 timer etter påføring av medikament. NSD-verdien til normalt musevev festet til tumor xenograft synker bare litt (0,6 til 0,52) sammenlignet med A2780. Fig. 2 viser cisplatin-medikamentresponskurvene. NSD-verdien for hvert punkt beregnes i gjennomsnitt over hele målet. Tiden mellom målingene er 24 minutter for A2780-CP70 og normalt musevev og er 12 minutter for A2780. 20 μM cisplatin ble påført ved tiden t = 0, og målingene varte i 9 timer for A2780-CP70 og normalt musevev, og varte i 8 timer for A2780. Ved tidspunkt = 0 har den aggressive cellelinjen A2780-CP70 den høyeste NSD og normal muse-mesenteriumvev har laveste NSD (0,6). NSD for den platinafølsomme cellelinjen A2780 ligger i midten: 0,7. Etter påføring av cisplatin synker NSD-kurven til A2780 umiddelbart. NSD-verdien til A2780-CP70 endres nesten ikke.

Fig. 2 Motilitetsmetrik (NSD) for ovariekrefttumor xenografter som reagerer på 20 μM cisplatin. X-aksen er tid (minutt), y-aksen er NSD-verdi. Den sensitive svulsten er A2780, mens den ufølsomme svulsten A2780-CP70. Begge tumorvev begynner med høyere motilitet enn normalt musevev. Cisplatinet ble tilsatt ved tidspunktet t=0. NSD-en til A2780 falt veldig raskt og etter 8 timer falt den til 0,1. NSD for den ufølsomme svulsten A2780-CP70 endret seg ikke i løpet av 9 timers perioden. NSD for normalt musevev falt litt sammenlignet med A2780.

I en ytterligere studie i en veterinær klinisk setting har MCT blitt brukt til å forutsi pasientutfall for canine non-Hodgkins lymfom. Canine non-Hodgkins lymfomer er i utgangspunktet preget av tumorinfiltrasjon av perifere lymfeknuter. Canine non-Hodgkins lymfomer er forskjellige i sin kliniske aggressivitet og respons på kjemoterapi. Den eneste nåværende biomarkøren for kjemorespons er tumorcelleimmunofenotype (dvs. T-celle vs. B-celle opprinnelse), men kjemorespons varierer enormt innenfor immunfenotype, noe som reduserer den kliniske nytten av denne biomarkøren. I vår studie brukte vi MCT for å måle den heterogene responsen fra hundelymfombiopsier på standard-of-care doxorubicin. De biodynamiske signaturene til doksorubicin-responsivitet ex vivo var korrelert med utfall hos hundepasienter. Disse studiene har for første gang vist nytten av merkefrie intracellulære biodynamiske markører for å forutsi terapeutisk effekt for kreftbehandling hos hunder.

SPESIFIKKE MÅL Hovedmålet med studien er å undersøke muligheten for å bruke MCT som en kjemosensitivitetsanalyse blant brystkreftpasienter som mottar neoadjuvant kjemoterapi ved å sammenligne MCT-mønstre som samsvarer med kjemoterapirespons eller resistens ex-vivo mot bekreftet respons eller resistens mot kjemoterapi målt ved responsevaluering Kriterier i solide svulster (RECIST) v1.1 kriterier.

PRIMÆRT ENDPUNKT: Objektiv patologisk respons målt på operasjonstidspunktet.