Onco4D(TM) Biodynamische Chemotherapie-Auswahl für Brustkrebspatientinnen

BEGRÜNDUNG DER STUDIE: Die nachgewiesene Fähigkeit der MCT, Tumor-Xenotransplantate genau zu beurteilen, könnte sie als zuverlässige Technik zur Tumorstratifizierung von Patienten basierend auf dem vorhergesagten Ansprechen auf die Therapie etablieren, was eine Behandlungsauswahl basierend auf den persönlichen Bedürfnissen eines einzelnen Patienten ermöglichen könnte. Ziel dieser Studie ist es, MCT als Test zur Vorhersage der Chemosensitivität gegenüber der Behandlung mit Chemotherapeutika zu bewerten, die routinemäßig in der neoadjuvanten und adjuvanten Behandlung von Brustkrebs eingesetzt werden. Im positiven Fall werden die Ergebnisse dieser Studie die Grundlage für erweiterte klinische Studien und den Einsatz von MCT bei der Therapieauswahl bilden.

HINTERGRUND: Die Bildgebung lebender Zellen ist zum Standard für High-Content-Analyse- und Arzneimittelforschungsanwendungen geworden. Zu den gebräuchlichsten Tests an lebenden Zellen gehören Lebensfähigkeits-, Proliferations- und Zytotoxizitätstests, bei denen die Zellphysiologie und -funktion als Reaktion auf angewandte Störungen durch Xenobiotika gemessen wird. Zell- und Gewebelebensfähigkeitstests werden typischerweise unter Verwendung exogener Vitalfarbstoffe als Biomarker für die Membranintegrität oder die zelluläre Stoffwechselaktivität gemessen. Farbstoffe sind jedoch invasiv, potenziell toxisch und erfordern häufig eine Fixierung des Gewebes oder eine Permeabilisierung der Membranen [1, 2]. Darüber hinaus erfordert das gängige Format der High-Content-Analyse und der Durchflusszytometrie isolierte Zellen oder Zellen, die auf flachen, harten Oberflächen verteilt sind. Isolierten Zellen fehlen viele der biologisch relevanten interzellulären Verbindungen und Kommunikationen, die für gesundes Gewebe charakteristisch sind [3, 4], und abgeflachte Zellen auf Platten weisen pathologische Formen und anisotrope Zelladhäsionen auf [5].

Die Entdeckung einer Technologie, die das Ansprechen auf eine Krebstherapie vorhersagen kann, hat dringende Priorität. Während viele Technologien existieren, um die frühe Reaktion auf Arzneimittel ex vivo zu bewerten, wird die Notwendigkeit, Lebensfähigkeits-, Zytotoxizitäts- und Proliferationstests in dreidimensionalem Gewebe oder Kultur durchzuführen, immer dringlicher [6, 7], da die Arzneimittelreaktion in 2D oft nicht die gleiche ist als Arzneimittelreaktion in biologisch relevanten dreidimensionalen Kulturen. Dies liegt zum Teil daran, dass genomische Profile in Monoschichtkulturen nicht erhalten bleiben [8–10]. Es gab mehrere Studien, die die Expression von Genen verfolgten, die mit dem Überleben, der Proliferation, der Differenzierung und der Therapieresistenz von Zellen verbunden sind und in 2D-Kulturen anders ausgedrückt werden als in dreidimensionalen Kulturen. Beispielsweise zeigen Zelllinien von epithelialem Eierstockkrebs [11, 12], hepatozellulärem Karzinom [13-15] oder Dickdarmkrebs [16] Expressionsprofile, die denen von Tumorgeweben ähneln, wenn sie in dreidimensionaler Kultur gemessen werden, nicht jedoch, wenn sie darin gezüchtet werden 2D. Darüber hinaus weist die dreidimensionale Umgebung der 3D-Kultur eine andere Pharmakokinetik auf als die der 2D-Monoschichtkultur und führt zu Unterschieden in der Empfindlichkeit gegenüber Krebsmedikamenten [17–20]. Schließlich basieren die meisten aktuellen Technologien auf einer destruktiven Endpunktbewertung, was eine sinnvolle Längsschnittbeobachtung des Therapieansprechens über einen längeren Zeitraum hinweg verhindert.

Eine der größten Herausforderungen bei der Migration von Arzneimittelwirkungstests in die dritte und vierte Dimension bestand darin, eine Möglichkeit zu finden, lebenswichtige Informationen tief (bis zu einem Millimeter) im lebenden Gewebe zu extrahieren. Gewebe ist durchscheinend und Licht kann sich diffus über viele Zentimeter ausbreiten. Darüber hinaus verursachen die dynamischen Bewegungen lebender Zellen eine dynamische Lichtstreuung, die Phasenschwankungen auf den Streulichtfeldern erzeugt, die als dynamische Speckle in diffus reflektiertem Licht vom Gewebe gemessen werden können. Dies ist die Grundlage der Diffusionswellenspektroskopie (DWS) [21, 22] und der Diffusionskorrelationsspektroskopie (DCS) [23–26], diesen Techniken fehlt jedoch die Tiefenauflösung. Ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung der Lichtausbreitung in Geweben ist der Einsatz der Interferometrie [27]. Die interferometrische Erkennung ist der zugrunde liegende Prozess der optischen Kohärenztomographie (OCT) [28–31], einer Punktscantechnik, die Speckle unterdrückt [32–34], obwohl die Speckle-Dekorrelation in OCT-Daten ähnliche Informationen liefern kann wie DCS. Dies wurde verwendet, um die intrazelluläre Rheologie zu messen [35] und dynamische Signaturen der Apoptose zu finden [36]. Der Transport kann auch mit Phasenkontrastmikroskopie in zellulärer Auflösung nachgewiesen werden [38], dieser Ansatz kann jedoch nicht in dicken Geweben angewendet werden.

Dr. Nolte und Kollegen haben eine volumetrisch aufgelöste gewebedynamische Bildgebung entwickelt, die die Vorteile der Tiefenselektivität der Interferometrie mit niedriger Kohärenz in Kombination mit einem hohen Speckle-Kontrast in der digitalen Holographie mit breiter Beleuchtung nutzt. Die Technik heißt Motilitätskontrasttomographie (MCT) und nutzt digitale Holographie mit niedriger Kohärenz, um bis zu 1 Millimeter in lebendes Gewebe einzudringen, um die Speckle-Dynamik aus der Lichtstreuung durch dynamische Bewegung in lebenden Zellen zu messen [37]. Es wurde zuvor als Zytotoxizitätstest eingesetzt, um die Wirksamkeit antimitotischer Arzneimittel zu untersuchen [40]. Im Wesentlichen funktioniert die Technologie durch die Profilierung der „Bewegung“ zellulärer Organellen. Spezifische Veränderungen in der Organellenbewegung sind in Zellen, die auf eine Chemotherapie ansprechen, sehr früh erkennbar und können als früher Prädiktor für das Ansprechen auf eine Chemotherapie verwendet werden.

Die MCT basiert auf der optischen Kohärenzbildgebung (OCI) [38]. OCI ist eine Vollfeld-Kurzkohärenzholographie [39], die rückgestreute Speckle sammelt. Mit Hilfe des Kohärenz-Gatings kann OCI Gewebe bis zu einer Tiefe von 1 mm optisch schneiden. MCT nutzt speziell die intrazelluläre Bewegung als endogenen Kontrast, um die subzelluläre Bewegung im Submikronbereich innerhalb von dreidimensionalem lebendem Gewebe zu charakterisieren [42].

Abbildung 1 zeigt das holographische Aufzeichnungsprinzip von MCT. Nach der Kalibrierung wird das Kurzkohärenzlicht zunächst in einen Objektstrahl und einen Referenzstrahl aufgeteilt. Der Objektstrahl trifft auf die lebende Gewebeprobe und vom Gewebe zurückgestreute Flecken werden von der Linse L1 gesammelt. Die lebende Gewebeprobe befindet sich in der Brennebene der Linse L1, sodass L1 auch eine optische Fourier-Transformation des rückgestreuten Lichts durchführt. Das ladungsgekoppelte Bauelement (CCD) befindet sich in der anderen Brennebene von L1 und fängt so das Fourier-transformierte Streulicht vom Gewebe ein. Der Referenzstrahl wird von einer Verzögerungsstufe (in der Abbildung nicht dargestellt) gesteuert, um die Weglänge des Referenzstrahls anzupassen und eine Nullpfadanpassung zwischen dem Objekt- und dem Referenzstrahl durchzuführen. Der Strahlteiler kombiniert beide Strahlen und interferiert aufgrund ihrer Nullpfadanpassung auf der CCD-Ebene. Der Referenzstrahl ist in einer Off-Axis-Konfiguration um 20° geneigt und der Abstand der Interferenzstreifen (Λ) beträgt 3 Pixel (24 μm). Die Speckle-Größe (aspec) wird auf eine Breite von 3 Streifen (70 μm) eingestellt. Weitere Details zum Versuchsaufbau finden sich in Referenz [41].

Abb.1. Das Prinzip der MCT an mehrzelligen Tumorsphäroiden. Die biologische Probe befindet sich in der Bildebene der Linse L1. Das von der Probe rückgestreute Licht wird durch L1 Fourier-transformiert und mit dem Referenzstrahl auf dem CCD-Chip interferiert. Das Speckle-Hologramm wird auf der Fourier-Ebene mit einem 20°-Kreuzungswinkel mit dem Referenzstrahl aufgezeichnet. Beispiele für a) Rohes digitales Hologramm; b) rekonstruiertes Bild; c) MCI-Bild. O.A.: optische Achse; I.P.: Bildebene; L1: Linse; BS: Strahlteiler; CCD: Ladungsgekoppeltes Gerät.

EX-VIVO-CHEMOSENSITIVITÄTSANALYSE VON KREBS MCT wurde zuvor zur Untersuchung der Wirksamkeit antimitotischer Medikamente unter Verwendung mehrzelliger Tumorsphäroide eingesetzt [40]. Bei der Anwendung von MCT auf Tumor-Xenotransplantate kann es unter Cisplatin auch zu einer deutlich unterschiedlichen Reaktion zwischen zwei Zelllinien kommen. Nach der Anwendung des Arzneimittels sinkt der normalisierte Standardabweichungswert (NSD) der platinempfindlichen Zelllinie (A2780) innerhalb von 8 Stunden von 0,7 auf 0,1. Im Gegensatz dazu bleibt der NSD-Wert der platinresistenten Zelllinie (A2780-CP70) 9 Stunden nach der Medikamentengabe nahezu konstant (0,81 bis 0,80). Der NSD-Wert von normalem Mausgewebe, das am Tumor-Xenotransplantat befestigt ist, sinkt im Vergleich zu A2780 nur geringfügig (0,6 bis 0,52). Abb. 2 zeigt die Cisplatin-Wirkungskurven. Der NSD-Wert jedes Punktes wird über das gesamte Ziel gemittelt. Die Zeit zwischen den Messungen beträgt 24 Minuten für A2780-CP70 und normales Mausgewebe und 12 Minuten für A2780. Die 20 μM Cisplatin wurden zum Zeitpunkt t = 0 aufgetragen und die Messungen dauerten 9 Stunden für A2780-CP70 und normales Mausgewebe und 8 Stunden für A2780. Zum Zeitpunkt = 0 weist die aggressive Zelllinie A2780-CP70 den höchsten NSD auf und das normale Mesenteriumgewebe der Maus weist den niedrigsten NSD auf (0,6). Der NSD der platinsensitiven Zelllinie A2780 liegt im Mittelfeld: 0,7. Nach der Anwendung von Cisplatin sinkt die NSD-Kurve von A2780 sofort. Der NSD-Wert des A2780-CP70 ändert sich nahezu nicht.

Abb. 2 Motilitätsmetrik (NSD) von Ovarialkarzinomtumor-Xenotransplantaten, die auf 20 μM Cisplatin ansprechen. Die x-Achse ist die Zeit (Minuten), die y-Achse ist der NSD-Wert. Der empfindliche Tumor ist A2780, während der unempfindliche Tumor A2780-CP70 ist. Beide Tumorgewebe beginnen mit einer höheren Motilität als normales Mausgewebe. Das Cisplatin wurde zum Zeitpunkt t=0 zugegeben. Der NSD des A2780 sank sehr schnell und fiel nach 8 Stunden auf 0,1. Die NSD des unempfindlichen Tumors A2780-CP70 veränderte sich während des 9-Stunden-Zeitraums nicht. Die NSD von normalem Mausgewebe sank im Vergleich zum A2780 etwas.

In einer weiteren Studie im veterinärmedizinischen Umfeld wurde MCT verwendet, um das Behandlungsergebnis für das Non-Hodgkin-Lymphom des Hundes vorherzusagen. Non-Hodgkin-Lymphome bei Hunden sind zunächst durch eine Tumorinfiltration peripherer Lymphknoten gekennzeichnet. Non-Hodgkin-Lymphome bei Hunden unterscheiden sich in ihrer klinischen Aggressivität und ihrem Ansprechen auf eine Chemotherapie. Der einzige aktuelle Biomarker für die Chemoreaktivität ist der Immunphänotyp der Tumorzellen (d. h. T-Zell- vs. B-Zell-Ursprung), aber die Chemoreaktion variiert erheblich innerhalb des Immunphänotyps, was den klinischen Nutzen dieses Biomarkers verringert. In unserer Studie verwendeten wir MCT, um die heterogene Reaktion von Hunde-Lymphom-Biopsien auf das Standardmedikament Doxorubicin zu messen. Die biodynamischen Signaturen der Doxorubicin-Reaktivität ex vivo korrelierten mit dem Ergebnis bei Hundepatienten. Diese Studien haben zum ersten Mal den Nutzen markierungsfreier intrazellulärer biodynamischer Marker zur Vorhersage der therapeutischen Wirksamkeit bei der Krebsbehandlung bei Hunden gezeigt.

SPEZIFISCHE ZIELE Das primäre Studienziel besteht darin, die Machbarkeit der Verwendung von MCT als Chemosensitivitätstest bei Brustkrebspatientinnen zu untersuchen, die eine neoadjuvante Chemotherapie erhalten, indem MCT-Muster verglichen werden, die mit dem Ansprechen auf die Chemotherapie oder der Resistenz ex vivo übereinstimmen, mit dem bestätigten Ansprechen oder der Resistenz gegen die Chemotherapie, gemessen durch die Bewertung der Reaktion Kriterien bei soliden Tumoren (RECIST) v1.1.

PRIMÄRER ENDPUNKT: Objektive pathologische Reaktion, gemessen zum Zeitpunkt der Operation.