Onco4D(TM) biodynamisk kemoterapiurval för bröstcancerpatienter

STUDIENS RATIONAL: MCT:s påvisade förmåga att noggrant bedöma tumörxenotransplantat kan etablera det som en tillförlitlig teknik för patienttumörstratifiering baserat på förutsagt svar på terapi, vilket skulle kunna möjliggöra ett behandlingsval baserat på en enskild patients personliga behov. Denna studie är utformad för att bedöma MCT som en analys för att förutsäga kemokänslighet för behandling med kemoterapimedel som rutinmässigt används vid neoadjuvant och adjuvant behandling av bröstcancer. Om de är positiva kommer resultaten av denna studie att utgöra grunden för utökade kliniska prövningar och användning av MCT vid val av terapi.

BAKGRUND: Levande cellavbildning har blivit standarden för högt innehållsanalys och läkemedelsupptäcktstillämpningar. De vanligaste analyserna på levande celler inkluderar viabilitets-, proliferations- och cytotoxicitetsanalyser eftersom cellulär fysiologi och funktion mäts som svar på applicerade störningar av xenobiotika. Cell- och vävnadsviabilitetsanalyser mäts vanligtvis med användning av exogena vitala färgämnen som biomarkörer för membranintegritet eller cellulär metabolisk aktivitet. Men färgämnen är invasiva, potentiellt giftiga och kräver ofta fixering av vävnaden eller permeabilisering av membranen [1, 2]. Dessutom kräver det vanliga formatet av höghaltsanalys och flödescytometri isolerade celler, eller celler fördelade på plana hårda ytor. Isolerade celler saknar många av de biologiskt relevanta intercellulära förbindelserna och kommunikationerna som är kännetecken för frisk vävnad [3, 4], och tillplattade celler på plattor har patologiska former och anisotropa cellulära adhesioner [5].

Upptäckten av teknik som kan förutsäga respons på cancerterapi är en brådskande prioritet. Medan det finns många tekniker för att utvärdera tidig respons på droger ex vivo, har behovet av att utföra livskrafts-, cytotoxicitets- och proliferationsanalyser i tredimensionell vävnad eller kultur blivit allt mer brådskande [6, 7], eftersom läkemedelssvar i 2D ofta inte är detsamma. som läkemedelssvar i biologiskt relevant tredimensionell kultur. Detta beror delvis på att genomiska profiler inte bevaras i monolagerkulturer [8-10]. Det har gjorts flera studier som har spårat uttrycket av gener associerade med cellöverlevnad, proliferation, differentiering och resistens mot terapi som uttrycks annorlunda i 2D-kulturer i förhållande till tredimensionell kultur. Till exempel visar cellinjer av epitelial äggstockscancer [11, 12], hepatocellulärt karcinom [13-15] eller tjocktarmscancer [16] uttrycksprofiler mer som de från tumörvävnader när de mäts i tredimensionell kultur, men inte när de odlas i 2D. Dessutom presenterar den tredimensionella miljön för 3D-kultur en annan farmakokinetik än 2D-monolagerkultur och producerar skillnader i cancerläkemedelskänslighet [17-20]. Slutligen förlitar sig de flesta nuvarande teknologier på destruktiv slutpunktsbedömning, vilket förhindrar meningsfull longitudinell observation av terapisvar över tid.

En av de största utmaningarna för att migrera läkemedelsresponsanalyser till den tredje och fjärde dimensionen har varit att hitta ett sätt att extrahera viktig information från djupt (upp till en millimeter) inuti levande vävnad. Vävnad är genomskinlig och ljus kan spridas diffust många centimeter. Vidare orsakar levande cellers dynamiska rörelser dynamisk ljusspridning som ger fasfluktuationer på de spridda ljusfälten som kan mätas som dynamiska fläckar i diffust reflekterat ljus från vävnad. Detta är grunden för diffusionsvågspektroskopi (DWS) [21, 22] och diffusionskorrelationsspektroskopi (DCS) [23-26], men dessa tekniker saknar djupupplösning. Ett kraftfullt verktyg för att karakterisera ljusutbredning i vävnader är användningen av interferometri [27]. Interferometrisk detektering är den underliggande processen i optisk koherenstomografi (OCT) [28-31], vilket är en punktskanningsteknik som undertrycker fläckar [32-34], även om fläckdekorrelation i OCT-data kan ge liknande information som tillhandahålls av DCS. Detta har använts för att mäta intracellulär reologi [35] och för att hitta dynamiska signaturer av apoptos [36]. Transport kan också detekteras vid cellupplösning med hjälp av faskontrastmikroskopi [38], men detta tillvägagångssätt kan inte användas i tjocka vävnader.

Dr. Nolte och kollegor har utvecklat volymetriskt upplöst vävnadsdynamisk avbildning som använder fördelarna med djupselektivitet från lågkoherens interferometri, kombinerat med hög fläckkontrast i digital holografi med bred belysning. Tekniken kallas Motility Contrast Tomography (MCT) och använder lågkoherens digital holografi för att penetrera upp till 1 millimeter in i levande vävnad för att mäta fläckdynamik från ljusspridning från dynamisk rörelse i levande celler [37]. Det användes tidigare som en cytotoxicitetsanalys för att studera effekten av antimitotiska läkemedel [40]. I huvudsak fungerar tekniken genom att profilera "rörelserna" av cellulära organeller. Specifika förändringar i organellrörelser kan detekteras mycket tidigt i celler som genomgår svar på kemoterapibehandling, och kan vara användbara som en tidig prediktor för kemoterapisvar.

MCT är baserad på optisk koherensavbildning (OCI) [38]. OCI är en helfälts holografi med kort koherens [39] som samlar tillbaka spridda fläckar. Med hjälp av coherence gating kan OCI optiskt snitta vävnad upp till 1 mm djup. MCT använder specifikt intracellulär rörelse som den endogena kontrasten för att karakterisera submikron subcellulär rörelse inuti tredimensionell levande vävnad [42].

Figur 1 visar den holografiska inspelningsprincipen för MCT. Efter kalibrering delas det korta koherensljuset först upp i en objektstråle och en referensstråle. Objektstrålen träffar det levande vävnadsprovet och tillbakaspridda fläckar från vävnaden samlas upp av linsen L1. Det levande vävnadsprovet lokaliseras i fokalplanet för linsen L1, så L1 utför också en optisk Fouriertransform av det bakåtspridda ljuset. Den laddningskopplade enheten (CCD) lokaliseras i det andra fokalplanet av L1, så den fångar det Fouriertransformerade spridningsljuset från vävnaden. Referensstrålen styrs av ett fördröjningssteg (visas inte i figuren) för att justera väglängden för referensstrålen för att utföra en nollvägsmatchning mellan objektet och referensstrålarna. Stråldelaren kombinerar båda strålarna och eftersom de är nollvägsmatchade stör de i CCD-planet. Referensstrålen lutas 20° i en konfiguration utanför axeln, och avståndet mellan interferensfransarna (Λ) är 3 pixlar (24 μm). Fläckstorleken (aspec) är justerad för att vara 3 fransar breda (70 μm). Ytterligare detaljer om experimentuppställningen finns i referens [41].

Figur 1. Principen för MCT på flercelliga tumörsfäroider. Det biologiska provet är beläget vid bildplanet för lins L1. Det bakåtspridda ljuset från provet är Fourier-transformerat av L1 och störs av referensstrålen på CCD-chippet. Specklehologrammet är registrerat på Fourierplanet med en 20 korsande ängel med referensstrålen. Exempel på a) Rå digitalt hologram; b) rekonstruerad bild; c) MCI-bild. O.A.: optisk axel; I.P.: bildplan; L1: lins; BS: stråldelare; CCD: laddningskopplad enhet.

EX VIVO CANCER KEMOSENSITIVITETSANALYS MCT användes tidigare för att studera effekten av antimitotiska läkemedel med användning av flercelliga tumörsfäroider [40]. När MCT appliceras på tumörxenotransplantat kan den också visa ett signifikant annorlunda svar mellan två cellinjer under cisplatin. Efter applicering av läkemedlet sjunker det normaliserade standardavvikelsen (NSD)-värdet för den platinakänsliga cellinjen (A2780) från 0,7 till 0,1 på 8 timmar. Däremot förblir NSD-värdet för den platinaresistenta cellinjen (A2780-CP70) nästan konstant (0,81 till 0,80) 9 timmar efter applicering av läkemedel. NSD-värdet för normal musvävnad fäst vid tumörxenotransplantatet minskar endast lite (0,6 till 0,52) jämfört med A2780. Fig. 2 visar cisplatinläkemedelssvarskurvorna. NSD-värdet för varje punkt beräknas i medeltal över hela målet. Tiden mellan mätningarna är 24 minuter för A2780-CP70 och normal musvävnad och är 12 minuter för A2780. 20 μM cisplatin applicerades vid tidpunkten t = 0, och mätningarna varade i 9 timmar för A2780-CP70 och normal musvävnad och varade i 8 timmar för A2780. Vid tidpunkten=0 har den aggressiva cellinjen A2780-CP70 den högsta NSD och den normala musmesenteriumvävnaden har lägst NSD (0,6). NSD för den platinakänsliga cellinjen A2780 ligger i mitten: 0,7. Efter applicering av cisplatin sjunker NSD-kurvan för A2780 omedelbart. NSD-värdet för A2780-CP70 ändras nästan inte.

Fig. 2 Motilitetsmått (NSD) för äggstockscancertumörxenotransplantat som svarar på 20 μM cisplatin. X-axeln är tid (minut), y-axeln är NSD-värde. Den känsliga tumören är A2780, medan den okänsliga tumören A2780-CP70. Båda tumörvävnaderna börjar med högre motilitet än normal musvävnad. Cisplatinet tillsattes vid tidpunkten t=0. NSD för A2780 sjönk väldigt snabbt och efter 8 timmar sjönk den till 0,1. NSD för den okänsliga tumören A2780-CP70 förändrades inte under 9 timmarsperioden. NSD för normal musvävnad sjönk något jämfört med A2780.

I en ytterligare studie i en veterinär klinisk miljö har MCT använts för att förutsäga patientresultat för non-Hodgkins lymfom hos hund. Canine non-Hodgkins lymfom kännetecknas initialt av tumörinfiltration av perifera lymfkörtlar. Canine non-Hodgkins lymfom är olika i sin kliniska aggressivitet och svar på kemoterapi. Den enda nuvarande biomarkören för kemorespons är tumörcellsimmunfenotyp (dvs. T-cell vs. B-cellsursprung), men kemoresponsiviteten varierar enormt inom immunfenotyp, vilket minskar den kliniska användbarheten av denna biomarkör. I vår studie använde vi MCT för att mäta det heterogena svaret av hundlymfombiopsier på standard-of-care doxorubicin. De biodynamiska signaturerna för doxorubicinrespons ex vivo korrelerades med resultatet hos hundpatienter. Dessa studier har för första gången visat användbarheten av etikettfria intracellulära biodynamiska markörer för att förutsäga terapeutisk effekt för cancerbehandling hos hundar.

SÄRSKILDA MÅL Det primära studiens mål är att undersöka genomförbarheten av att använda MCT som en kemosensitivitetsanalys bland bröstcancerpatienter som får neoadjuvant kemoterapi genom att jämföra MCT-mönster som överensstämmer med kemoterapisvar eller resistens ex-vivo mot bekräftat svar eller resistens mot kemoterapi mätt med svarsutvärdering Kriterier i solida tumörer (RECIST) v1.1 kriterier.

PRIMÄR ENDPOINT: Objektivt patologiskt svar uppmätt vid tidpunkten för operationen.