Selección de quimioterapia biodinámica Onco4D(TM) para pacientes con cáncer de mama

FUNDAMENTO DEL ESTUDIO: La capacidad demostrada de MCT para evaluar con precisión los xenoinjertos tumorales puede establecerla como una técnica confiable para la estratificación del tumor del paciente en función de la respuesta prevista a la terapia, lo que podría permitir una selección de tratamiento basada en las necesidades personales de un paciente individual. Este estudio está diseñado para evaluar MCT como un ensayo para predecir la quimiosensibilidad al tratamiento con agentes de quimioterapia utilizados habitualmente en el tratamiento neoadyuvante y adyuvante del cáncer de mama. Si es positivo, los resultados de este estudio proporcionarán la base para ensayos clínicos ampliados y el uso de MCT en la selección de terapias.

ANTECEDENTES: Las imágenes de células vivas se han convertido en el estándar para el análisis de alto contenido y las aplicaciones de descubrimiento de fármacos. Los ensayos más comunes en células vivas incluyen ensayos de viabilidad, proliferación y citotoxicidad, ya que la fisiología celular y la función se miden en respuesta a las perturbaciones aplicadas de los xenobióticos. Los ensayos de viabilidad celular y tisular normalmente se miden utilizando colorantes vitales exógenos como biomarcadores de la integridad de la membrana o la actividad metabólica celular. Sin embargo, los colorantes son invasivos, potencialmente tóxicos y, a menudo, requieren la fijación del tejido o la permeabilización de las membranas [1, 2]. Además, el formato común de análisis de alto contenido y citometría de flujo requiere células aisladas o células distribuidas en superficies planas y duras. Las células aisladas carecen de muchas de las conexiones y comunicaciones intercelulares biológicamente relevantes que son características del tejido sano [3, 4], y las células aplanadas en las placas tienen formas patológicas y adherencias celulares anisotrópicas [5].

El descubrimiento de tecnología que pueda predecir la respuesta a la terapia del cáncer es una prioridad urgente. Si bien existen muchas tecnologías para evaluar la respuesta temprana a los medicamentos ex vivo, la necesidad de realizar ensayos de viabilidad, citotoxicidad y proliferación en tejidos o cultivos tridimensionales se ha vuelto cada vez más urgente [6, 7], ya que la respuesta a los medicamentos en 2D a menudo no es la misma como respuesta a fármacos en cultivos tridimensionales biológicamente relevantes. Esto se debe en parte a que los perfiles genómicos no se conservan en cultivos monocapa [8-10]. Ha habido varios estudios que han rastreado la expresión de genes asociados con la supervivencia celular, proliferación, diferenciación y resistencia a la terapia que se expresan de manera diferente en cultivos 2D en relación con el cultivo tridimensional. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de ovario epitelial [11, 12], carcinoma hepatocelular [13-15] o cáncer de colon [16] muestran perfiles de expresión más parecidos a los de tejidos tumorales cuando se miden en cultivo tridimensional, pero no cuando se cultivan en 2D. Además, el entorno tridimensional del cultivo 3D presenta una farmacocinética diferente al cultivo monocapa 2D y produce diferencias en la sensibilidad a los fármacos contra el cáncer [17-20]. Finalmente, la mayoría de las tecnologías actuales se basan en la evaluación destructiva del punto final, lo que impide una observación longitudinal significativa de la respuesta a la terapia a lo largo del tiempo.

Uno de los principales desafíos para migrar los ensayos de respuesta a fármacos a la tercera y cuarta dimensión ha sido encontrar un medio para extraer información vital de la profundidad (hasta un milímetro) dentro del tejido vivo. El tejido es translúcido y la luz puede propagarse difusivamente muchos centímetros. Además, los movimientos dinámicos de las células vivas provocan una dispersión dinámica de la luz que produce fluctuaciones de fase en los campos de luz dispersa que se pueden medir como motas dinámicas en la luz difusamente reflejada del tejido. Esta es la base de la espectroscopia de onda de difusión (DWS) [21, 22] y la espectroscopia de correlación de difusión (DCS) [23-26], pero estas técnicas carecen de resolución de profundidad. Una poderosa herramienta en la caracterización de la propagación de la luz en los tejidos es el uso de la interferometría [27]. La detección interferométrica es el proceso subyacente en la tomografía de coherencia óptica (OCT) [28-31], que es una técnica de escaneo de puntos que suprime el moteado [32-34], aunque la descorrelación del moteado en los datos de OCT puede proporcionar información similar a la proporcionada por DCS. Esto se ha utilizado para medir la reología intracelular [35] y para encontrar firmas dinámicas de apoptosis [36]. El transporte también se puede detectar con resolución celular usando microscopía de contraste de fase [38], pero este enfoque no se puede usar en tejidos gruesos.

El Dr. Nolte y sus colegas han desarrollado imágenes dinámicas de tejidos de resolución volumétrica que utilizan las ventajas de la selectividad de profundidad de la interferometría de baja coherencia, combinadas con un alto contraste moteado en la holografía digital de iluminación amplia. La técnica se llama tomografía de contraste de motilidad (MCT) y utiliza holografía digital de baja coherencia para penetrar hasta 1 milímetro en el tejido vivo para medir la dinámica de las manchas de la dispersión de la luz del movimiento dinámico en las células vivas [37]. Anteriormente se aplicó como un ensayo de citotoxicidad para estudiar la eficacia de los fármacos antimitóticos [40]. En esencia, la tecnología funciona perfilando el "movimiento" de los orgánulos celulares. Los cambios específicos en el movimiento de los orgánulos se detectan muy temprano en las células que responden al tratamiento de quimioterapia y pueden usarse como un predictor temprano de la respuesta a la quimioterapia.

MCT se basa en imágenes de coherencia óptica (OCI) [38]. OCI es una holografía de coherencia corta de campo completo [39] que recopila motas retrodispersadas. Con la ayuda del control de coherencia, OCI puede seccionar tejido ópticamente hasta 1 mm de profundidad. MCT utiliza específicamente el movimiento intracelular como contraste endógeno para caracterizar el movimiento subcelular submicrónico dentro del tejido vivo tridimensional [42].

La Figura 1 muestra el principio de grabación holográfica de MCT. Después de la calibración, la luz de coherencia corta se divide primero en un haz de objeto y un haz de referencia. El haz del objeto incide en la muestra de tejido vivo y la lente L1 recoge las motas retrodispersadas del tejido. La muestra de tejido vivo se ubica en el plano focal de la lente L1, por lo que L1 también realiza una transformada óptica de Fourier de la luz retrodispersada. El dispositivo de carga acoplada (CCD) se ubica en el otro plano focal de L1, por lo que captura la luz de dispersión transformada de Fourier del tejido. El haz de referencia está controlado por una etapa de retardo (no se muestra en la figura) para ajustar la longitud de la trayectoria del haz de referencia para realizar una coincidencia de trayectoria cero entre el objeto y los haces de referencia. El divisor de haz combina ambos haces y debido a que tienen una trayectoria cero coincidente, interfieren en el plano CCD. El haz de referencia está inclinado 20° en una configuración fuera del eje y la separación de las franjas de interferencia (Λ) es de 3 píxeles (24 μm). El tamaño de la mota (aspec) se ajusta para que tenga 3 franjas de ancho (70 μm). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre la configuración experimental en la referencia [41].

Figura 1. El principio de MCT en esferoides tumorales multicelulares. La muestra biológica se encuentra en el plano de imagen de la lente L1. La luz retrodispersada de la muestra es transformada por Fourier por L1 e interfiere con el haz de referencia en el chip CCD. El holograma moteado se registra en el plano de Fourier con un ángel de 20 cruces con el haz de referencia. Ejemplos de a) Holograma digital en bruto; b) imagen reconstruida; c) Imagen MCI. O.A.: eje óptico; I.P.: plano de la imagen; L1: lente; BS: divisor de haz; CCD: dispositivo de carga acoplada.

ANÁLISIS DE QUIMIOSENSIBILIDAD DEL CÁNCER EX VIVO La MCT se aplicó previamente para estudiar la eficacia de los fármacos antimitóticos utilizando esferoides tumorales multicelulares [40]. Cuando se aplica MCT a xenoinjertos tumorales, también es capaz de mostrar una respuesta significativamente diferente entre dos líneas celulares bajo cisplatino. Después de aplicar el fármaco, el valor de la desviación estándar normalizada (NSD) de la línea celular sensible al platino (A2780) cae de 0,7 a 0,1 en 8 horas. Por el contrario, el valor de NSD de la línea celular resistente al platino (A2780-CP70) permanece casi constante (0,81 a 0,80) 9 horas después de aplicar el fármaco. El valor de NSD del tejido de ratón normal adherido al xenoinjerto tumoral disminuye solo un poco (0,6 a 0,52) en comparación con A2780. La figura 2 muestra las curvas de respuesta al fármaco de cisplatino. El valor NSD de cada punto se promedia sobre todo el objetivo. El tiempo entre mediciones es de 24 minutos para A2780-CP70 y tejido normal de ratón y de 12 minutos para A2780. Se aplicó cisplatino 20 µM en el tiempo t = 0, y las mediciones duraron 9 horas para A2780-CP70 y tejido de ratón normal, y 8 horas para A2780. En el tiempo = 0, la línea celular agresiva A2780-CP70 tiene la NSD más alta y el tejido de mesenterio de ratón normal tiene la NSD más baja (0,6). La NSD de la línea celular sensible al platino A2780 se encuentra en el medio: 0,7. Después de aplicar cisplatino, la curva NSD de A2780 cae inmediatamente. El valor NSD del A2780-CP70 casi no cambia.

Fig. 2 Métrica de motilidad (NSD) de xenoinjertos de tumor de cáncer de ovario que responden a cisplatino 20 μM. El eje x es el tiempo (minuto), el eje y es el valor NSD. El tumor sensible es A2780, mientras que el tumor insensible A2780-CP70. Ambos tejidos tumorales comienzan con mayor motilidad que el tejido de ratón normal. El cisplatino se añadió en el tiempo t=0. El NSD de A2780 cayó muy rápido y después de 8 horas bajó a 0,1. La NSD del tumor insensible A2780-CP70 no cambió durante un período de 9 horas. La NSD del tejido de ratón normal se redujo un poco en comparación con el A2780.

En un estudio adicional en un entorno clínico veterinario, se utilizó MCT para predecir el resultado del paciente con linfoma no Hodgkin canino. Los linfomas no Hodgkin caninos se caracterizan inicialmente por la infiltración tumoral de los ganglios linfáticos periféricos. Los linfomas no Hodgkin caninos son diversos en cuanto a su agresividad clínica y respuesta a la quimioterapia. El único biomarcador actual para la quimiorespuesta es el inmunofenotipo de células tumorales (es decir, origen de células T frente a células B), pero la quimiorreactividad varía enormemente dentro del inmunofenotipo, lo que reduce la utilidad clínica de este biomarcador. En nuestro estudio, utilizamos MCT para medir la respuesta heterogénea de las biopsias de linfoma canino a la doxorrubicina estándar. Las firmas biodinámicas de la capacidad de respuesta a la doxorrubicina ex vivo se correlacionaron con el resultado del paciente canino. Estos estudios han demostrado, por primera vez, la utilidad de los marcadores biodinámicos intracelulares sin etiquetas para predecir la eficacia terapéutica del tratamiento del cáncer en perros.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS El objetivo principal del estudio es examinar la viabilidad de usar MCT como un ensayo de quimiosensibilidad entre pacientes con cáncer de mama que reciben quimioterapia neoadyuvante mediante la comparación de patrones de MCT consistentes con la respuesta a la quimioterapia o la resistencia ex vivo con la respuesta confirmada o la resistencia a la quimioterapia según lo medido por la Evaluación de respuesta Criterios en Tumores Sólidos (RECIST) v1.1 Criterios.

VALORACIÓN PRIMARIA: Respuesta patológica objetiva medida en el momento de la cirugía.