Selezione di chemioterapia biodinamica Onco4D(TM) per pazienti con cancro al seno

RAZIONALE DELLO STUDIO: La capacità dimostrata dell'MCT di valutare accuratamente gli xenotrapianti tumorali può stabilirlo come una tecnica affidabile per la stratificazione del tumore del paziente basata sulla risposta prevista alla terapia, che potrebbe consentire una selezione del trattamento basata sulle esigenze personali di un singolo paziente. Questo studio è progettato per valutare l'MCT come test per predire la chemiosensibilità al trattamento con agenti chemioterapici abitualmente utilizzati nel trattamento neoadiuvante e adiuvante del carcinoma mammario. Se positivi, i risultati di questo studio forniranno la base per studi clinici ampliati e l'uso di MCT nella selezione della terapia.

BACKGROUND: Live cell imaging è diventato lo standard per l'analisi ad alto contenuto e le applicazioni di scoperta della droga. I test più comuni sulle cellule vive includono i test di vitalità, proliferazione e citotossicità poiché la fisiologia e la funzione cellulare vengono misurate in risposta alle perturbazioni applicate degli xenobiotici. I test di vitalità cellulare e tissutale vengono tipicamente misurati utilizzando coloranti vitali esogeni come biomarcatori dell'integrità della membrana o dell'attività metabolica cellulare. Tuttavia, i coloranti sono invasivi, potenzialmente tossici e spesso richiedono il fissaggio del tessuto o la permeabilizzazione delle membrane [1, 2]. Inoltre, il formato comune di analisi ad alto contenuto e citometria a flusso richiede cellule isolate o cellule distribuite su superfici dure piatte. Le cellule isolate sono prive di molte delle connessioni e comunicazioni intercellulari biologicamente rilevanti che sono le caratteristiche del tessuto sano [3, 4], e le cellule appiattite sulle piastre hanno forme patologiche e aderenze cellulari anisotropiche [5].

La scoperta di una tecnologia in grado di prevedere la risposta alla terapia del cancro è una priorità urgente. Sebbene esistano molte tecnologie per valutare la risposta precoce ai farmaci ex vivo, la necessità di eseguire analisi di vitalità, citotossicità e proliferazione in tessuti o colture tridimensionali è diventata sempre più urgente [6, 7], poiché la risposta ai farmaci in 2D spesso non è la stessa come risposta ai farmaci nella cultura tridimensionale biologicamente rilevante. Ciò è in parte dovuto al fatto che i profili genomici non sono conservati nelle colture monostrato [8-10]. Sono stati condotti diversi studi che hanno monitorato l'espressione di geni associati alla sopravvivenza cellulare, alla proliferazione, alla differenziazione e alla resistenza alla terapia che sono espressi in modo diverso nelle colture 2D rispetto alla cultura tridimensionale. Ad esempio, linee cellulari di carcinoma ovarico epiteliale [11, 12], carcinoma epatocellulare [13-15] o carcinoma del colon [16] mostrano profili di espressione più simili a quelli dei tessuti tumorali quando misurati in coltura tridimensionale, ma non quando crescono in 2D. Inoltre, l'ambiente tridimensionale della coltura 3D presenta una farmacocinetica diversa rispetto alla coltura monostrato 2D e produce differenze nella sensibilità ai farmaci antitumorali [17-20]. Infine, la maggior parte delle tecnologie attuali si basa su una valutazione distruttiva dell'endpoint, impedendo un'osservazione longitudinale significativa della risposta terapeutica nel tempo.

Una delle principali sfide per la migrazione dei test di risposta ai farmaci alla terza e alla quarta dimensione è stata quella di trovare un mezzo per estrarre informazioni vitali dal profondo (fino a un millimetro) all'interno del tessuto vivente. Il tessuto è traslucido e la luce può propagarsi in modo diffusivo per molti centimetri. Inoltre, i movimenti dinamici delle cellule viventi causano una diffusione dinamica della luce che produce fluttuazioni di fase sui campi di luce diffusa che possono essere misurate come macchioline dinamiche nella luce diffusamente riflessa dal tessuto. Questa è la base della spettroscopia dell'onda di diffusione (DWS) [21, 22] e della spettroscopia di correlazione della diffusione (DCS) [23-26], ma queste tecniche mancano di risoluzione in profondità. Uno strumento potente nella caratterizzazione della propagazione della luce nei tessuti è l'uso dell'interferometria [27]. Il rilevamento interferometrico è il processo alla base della tomografia a coerenza ottica (OCT) [28-31], che è una tecnica di scansione puntuale che sopprime lo speckle [32-34], sebbene la decorrelazione dello speckle nei dati OCT possa fornire informazioni simili a quelle fornite dalla DCS. Questo è stato utilizzato per misurare la reologia intracellulare [35] e per trovare le firme dinamiche dell'apoptosi [36]. Il trasporto può anche essere rilevato alla risoluzione cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase [38], ma questo approccio non può essere utilizzato nei tessuti spessi.

Il Dr. Nolte e colleghi hanno sviluppato l'imaging dinamico dei tessuti a risoluzione volumetrica che utilizza i vantaggi della selettività della profondità dall'interferometria a bassa coerenza, combinata con un elevato contrasto speckle nell'olografia digitale ad ampia illuminazione. La tecnica si chiama Motility Contrast Tomography (MCT) e utilizza l'olografia digitale a bassa coerenza per penetrare fino a 1 millimetro nel tessuto vivente per misurare la dinamica delle macchioline dalla diffusione della luce dal movimento dinamico nelle cellule viventi [37]. È stato precedentemente applicato come test di citotossicità per studiare l'efficacia dei farmaci anti-mitotici [40]. In sostanza, la tecnologia funziona profilando il "movimento" degli organelli cellulari. Cambiamenti specifici nel movimento degli organelli sono rilevabili molto presto nelle cellule sottoposte a risposta al trattamento chemioterapico e possono essere utilizzati come predittore precoce della risposta chemioterapica.

MCT si basa sull'imaging a coerenza ottica (OCI) [38]. L'OCI è un'olografia a coerenza breve a campo pieno [39] che raccoglie i granelli retrodiffusi. Con l'aiuto del gating di coerenza, l'OCI può sezionare otticamente il tessuto fino a 1 mm di profondità. MCT utilizza specificamente il movimento intracellulare come contrasto endogeno per caratterizzare il movimento subcellulare submicronico all'interno del tessuto vivente tridimensionale [42].

La Figura 1 mostra il principio di registrazione olografica di MCT. Dopo la calibrazione, la luce di coerenza corta viene prima suddivisa in un raggio dell'oggetto e un raggio di riferimento. Il raggio dell'oggetto colpisce il campione di tessuto vivente e le macchie retrodiffuse dal tessuto vengono raccolte dalla lente L1. Il campione di tessuto vivente si trova sul piano focale della lente L1, quindi L1 esegue anche una trasformata ottica di Fourier della luce retrodiffusa. Il dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) si trova sull'altro piano focale di L1, quindi cattura la luce scattering trasformata di Fourier dal tessuto. Il raggio di riferimento è controllato da uno stadio di ritardo (non mostrato nella figura) per regolare la lunghezza del percorso del raggio di riferimento per eseguire una corrispondenza del percorso zero tra l'oggetto e i raggi di riferimento. Il divisore di raggio combina entrambi i raggi e poiché sono abbinati a percorso zero, interferiscono sul piano CCD. Il raggio di riferimento è inclinato di 20° in una configurazione fuori asse e la spaziatura delle frange di interferenza (Λ) è di 3 pixel (24 μm). La dimensione della macchiolina (aspec) è regolata in modo da essere larga 3 frange (70 μm). Ulteriori dettagli sulla configurazione sperimentale possono essere trovati in riferimento [41].

Fig. 1. Il principio della MCT sugli sferoidi tumorali multicellulari. Il campione biologico si trova sul piano dell'immagine della lente L1. La luce retrodiffusa dal campione è trasformata da Fourier da L1 e interferisce con il raggio di riferimento sul chip CCD. L'ologramma speckle è registrato sul piano di Fourier con un angolo di 20° che si incrocia con il raggio di riferimento. Esempi di a) Ologramma digitale grezzo; b) immagine ricostruita; c) Immagine MCI. O.A.: asse ottico; I.P.: piano dell'immagine; L1: lente; BS: divisore di fascio; CCD: dispositivo ad accoppiamento di carica.

ANALISI DELLA CHEMOSENSIBILITÀ DEL CANCRO EX VIVO L'MCT è stato precedentemente applicato per studiare l'efficacia dei farmaci anti-mitotici utilizzando sferoidi tumorali multicellulari [40]. Quando si applica MCT a xenotrapianti tumorali, è anche in grado di mostrare una risposta significativamente diversa tra due linee cellulari sotto cisplatino. Dopo l'applicazione del farmaco, il valore della deviazione standard normalizzata (NSD) della linea cellulare sensibile al platino (A2780) scende da 0,7 a 0,1 in 8 ore. Al contrario, il valore NSD della linea cellulare resistente al platino (A2780-CP70) rimane pressoché costante (da 0,81 a 0,80) 9 ore dopo l'applicazione del farmaco. Il valore NSD del normale tessuto di topo attaccato allo xenotrapianto tumorale diminuisce solo leggermente (da 0,6 a 0,52) rispetto all'A2780. La Fig. 2 mostra le curve di risposta al farmaco cisplatino. Il valore NSD di ciascun punto viene calcolato in media sull'intero obiettivo. L'intervallo tra le misurazioni è di 24 minuti per A2780-CP70 e tessuto di topo normale ed è di 12 minuti per A2780. Il cisplatino 20 μM è stato applicato al tempo t = 0 e le misurazioni sono durate 9 ore per A2780-CP70 e tessuto di topo normale e sono durate 8 ore per A2780. Al tempo = 0, la linea cellulare aggressiva A2780-CP70 ha il NSD più alto e il normale tessuto del mesenterio di topo ha il NSD più basso (0,6). L'NSD della linea cellulare sensibile al platino A2780 si trova nel mezzo: 0,7. Dopo l'applicazione del cisplatino, la curva NSD dell'A2780 diminuisce immediatamente. Il valore NSD dell'A2780-CP70 quasi non cambia.

Fig. 2 Metrica di motilità (NSD) di xenotrapianti tumorali di carcinoma ovarico che rispondono a 20 μM di cisplatino. L'asse x è il tempo (minuti), l'asse y è il valore NSD. Il tumore sensibile è A2780, mentre il tumore insensibile A2780-CP70. Entrambi i tessuti tumorali iniziano con una maggiore motilità rispetto al normale tessuto di topo. Il cisplatino è stato aggiunto al tempo t=0. L'NSD dell'A2780 è sceso molto velocemente e dopo 8 ore è sceso a 0,1. Il NSD del tumore insensibile A2780-CP70 non è cambiato durante il periodo di 9 ore. L'NSD del normale tessuto di topo è leggermente diminuito rispetto all'A2780.

In un ulteriore studio in ambito clinico veterinario, l'MCT è stato utilizzato per prevedere l'esito del paziente per il linfoma non Hodgkin canino. I linfomi canini non-Hodgkin sono inizialmente caratterizzati da infiltrazione tumorale dei linfonodi periferici. I linfomi canini non-Hodgkin sono diversi nella loro aggressività clinica e nella risposta alla chemioterapia. L'unico biomarcatore attuale per la chemoresponsività è l'immunofenotipo delle cellule tumorali (es. Origine da linfociti T vs. linfociti B), ma la chemoresponsività varia enormemente all'interno dell'immunofenotipo, il che riduce l'utilità clinica di questo biomarcatore. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato MCT per misurare la risposta eterogenea delle biopsie di linfoma canino alla doxorubicina standard. Le firme biodinamiche della responsività alla doxorubicina ex vivo erano correlate con l'esito del paziente canino. Questi studi hanno dimostrato, per la prima volta, l'utilità di marcatori biodinamici intracellulari privi di etichetta per prevedere l'efficacia terapeutica per il trattamento del cancro nei cani.

OBIETTIVI SPECIFICI L'obiettivo primario dello studio è esaminare la fattibilità dell'utilizzo di MCT come test di chemiosensibilità tra pazienti con carcinoma mammario che ricevono chemioterapia neoadiuvante confrontando i modelli MCT coerenti con la risposta alla chemioterapia o la resistenza ex-vivo alla risposta confermata o alla resistenza alla chemioterapia misurata dalla valutazione della risposta Criteri nei tumori solidi (RECIST) v1.1 criteri.

ENDPOINT PRIMARIO: risposta patologica obiettiva misurata al momento dell'intervento chirurgico.